許蘭杰，梁慧珍，余永亮，楊 青，李 磊，安素妨，楊紅旗，譚政委，李春明，董 薇，魯?shù)さ?/p>

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002）

艾（Artemisia argyi）為菊科（Compositae）蒿屬（Artemisia）多年生草本植物，是集藥品、食品、保健品于一體的大宗中藥材之一[1]。現(xiàn)代研究表明，艾葉含有豐富的礦物質(zhì)元素[2]、黃酮類[3]、揮發(fā)油類成分[4-5]等，具有溫經(jīng)活絡(luò)[6]、抗菌[7]、抗癌[8]、抗炎[9]、免疫調(diào)節(jié)[10]、抗凝血[11]等作用。艾分布于我國大部分地區(qū)以及朝鮮半島、日本、蒙古等亞洲東部[12]。在我國，艾主產(chǎn)于河南、湖北、湖南、安徽、山東和河北等。近年來，隨著中醫(yī)藥健康服務(wù)業(yè)的快速發(fā)展，艾產(chǎn)業(yè)的市場需求與日俱增。艾及其制品在治未病、美容護膚等方面的獨特作用得到了社會各界的廣泛認同，特別是深受日本、韓國客商的青睞，國際市場需求量大，前景極為廣闊。

河南省南陽市是國內(nèi)外公認的艾產(chǎn)業(yè)重要發(fā)源地，被譽為“世界艾鄉(xiāng)”，全市艾種植面積達2萬hm2，各縣區(qū)均有艾種植，是全國最大的艾原材料供應(yīng)基地[13]。南陽市艾產(chǎn)品年生產(chǎn)加工量占全球85%以上，南陽市簡稱宛，因此，所產(chǎn)的艾被外界統(tǒng)稱為“宛艾”。宛艾野生資源很多，栽培農(nóng)家品種也很多，現(xiàn)在推廣的一些品種，植株形態(tài)特點與產(chǎn)量和品質(zhì)方面優(yōu)勢并不穩(wěn)定，經(jīng)長期種植，品種特性逐漸喪失，急需培育新品種。

豐富多樣的種質(zhì)資源是開展植物新品種選育和基礎(chǔ)研究的必備條件之一。目前，關(guān)于艾的研究主要集中在其化學(xué)成分、生物活性以及栽培技術(shù)方面，資源評價方面的研究較少[14-17]。陳昌婕等[17]對來源于我國不同地區(qū)的艾種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀和葉片表型性狀進行了多樣性分析，并將其劃分為3 個類群。為充分了解南陽市艾種質(zhì)資源的遺傳多樣性，擬以30 個宛艾種質(zhì)為試驗材料，對其農(nóng)藝和品質(zhì)性狀進行分析測定，采用相關(guān)分析、主成分分析和聚類分析對其進行綜合評價，并基于隸屬函數(shù)法篩選優(yōu)異宛艾種質(zhì)，為開展宛艾新品種選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心收集的30 個宛艾種質(zhì)，分別編號Ai01—Ai30。其中，Ai01—Ai07 來自南陽市鄧州市、Ai08—Ai10 來自南陽市宛城區(qū)、Ai11—Ai17 來自南陽市桐柏縣、Ai18—Ai24 來自南召縣、Ai25—Ai27 來自南陽市唐河縣、Ai28—Ai30 來自南陽市方城縣。試驗材料于2021 年4 月10 日分株栽種于河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗示范基地（經(jīng)度113.71、緯度35.01）。試驗采取完全隨機區(qū)組設(shè)計，重復(fù)3 次，每個小區(qū)4 行，行長2 m、行距0.6 m、株距0.4 m，常規(guī)田間管理。

1.2 性狀調(diào)查

田間性狀調(diào)查于2021年6月10日進行，每個小區(qū)隨機取樣5 株進行室內(nèi)考種，調(diào)查株高、葉長、葉寬、葉柄長、主莖分枝高度、主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)間數(shù)、主莖節(jié)間長度、主莖葉片鮮質(zhì)量、主莖質(zhì)量共10個農(nóng)藝性狀。

1.3 品質(zhì)分析

共計5 個品質(zhì)性狀：采用索氏提取法提取艾葉揮發(fā)油含量；采用苯酚—硫酸法測定艾葉低聚糖含量和多糖含量；采用考馬斯亮藍法測定艾葉蛋白質(zhì)含量；采用蘆丁法測定艾葉總黃酮含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

采用Excel 2013 計算供試材料各性狀的最大值、最小值、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)。參考梁慧珍等[18]的方法，通過隸屬函數(shù)法將30 個宛艾種質(zhì)的15個性狀函數(shù)值定義在[0，1]區(qū)間內(nèi)，計算公式：Sin=（Xin-Ximin）/（Ximax-Ximin），式中，Sin表示第i指標(biāo)、第n個樣品的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后的隸屬函數(shù)值，Xin為第i指標(biāo)、第n個樣品的原始測定值，Ximin與Ximax為第i指標(biāo)在30 個宛艾種質(zhì)中的最小值和最大值。為了研究宛艾10 個農(nóng)藝性狀和5 個品質(zhì)性狀的遺傳多樣性，采用Shannon-weaver 遺傳多樣性指數(shù)（H′）進行遺傳多樣性評價，計算公式：H′=-∑Pi×lnPi（i=1，2，3，…，n），式中，Pi指某個性狀第i級別內(nèi)材料個數(shù)占總個數(shù)的百分比[19]。采用SPSS 20.0 軟件進行相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 宛艾種質(zhì)的遺傳多樣性分析

由圖1 可知，10 個農(nóng)藝性狀的H′差異較大，介于0.53（主莖分枝高度）～1.58（葉寬），平均為1.35；葉寬（1.58）、主莖節(jié)間數(shù)（1.56）、葉長（1.54）、株高（1.53）和葉柄長（1.53）的H′居10 個農(nóng)藝性狀的前列。5個品質(zhì)性狀的H′差異稍小，介于0.98（低聚糖含量）～1.55（總黃酮含量），平均為1.38；總黃酮含量（1.55）和揮發(fā)油含量（1.53）的H′居5 個品質(zhì)性狀的前列。

圖1 宛艾種質(zhì)15個性狀的遺傳多樣性指數(shù)Fig.1 Diversity index of 15 traits in Wan A.argyi germplasm

2.2 宛艾種質(zhì)的變異系數(shù)分析

對30 個供試宛艾種質(zhì)農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的變異系數(shù)進行比較，結(jié)果（表1）表明，15個性狀的變異系數(shù)為16.95%～160.71%，以主莖分枝高度的變異程度最高，變異系數(shù)最小的是總黃酮含量。10個農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)平均為52.14%，5 個品質(zhì)性狀的變異系數(shù)平均為24.00%。農(nóng)藝性狀的平均變異系數(shù)大于品質(zhì)性狀，說明宛艾種質(zhì)品質(zhì)性狀間的差異較小。

表1 宛艾種質(zhì)15個性狀的基本統(tǒng)計分析Tab.1 Basic statistical analysis of 15 traits in Wan A. argyi germplasm

續(xù)表1 宛艾種質(zhì)15個性狀的基本統(tǒng)計分析Tab.1（Continued） Basic statistical analysis of 15 traits in Wan A. argyi germplasm

2.3 宛艾種質(zhì)的相關(guān)性分析

相關(guān)分析（表2）表明，株高與主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)間數(shù)、主莖葉片鮮質(zhì)量、主莖質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)，與葉柄長呈顯著負相關(guān)。葉長與葉寬、葉柄長呈極顯著正相關(guān)，與主莖節(jié)間數(shù)呈顯著負相關(guān)。葉寬與葉柄長呈極顯著正相關(guān)，與主莖節(jié)間長度呈顯著正相關(guān)，與多糖含量呈極顯著負相關(guān)。葉柄長與主莖節(jié)間數(shù)呈極顯著負相關(guān)，與主莖分枝數(shù)、主莖葉片鮮質(zhì)量和主莖質(zhì)量呈顯著負相關(guān)。主莖分枝高度與主莖葉片鮮質(zhì)量呈顯著負相關(guān)，與低聚糖含量呈極顯著正相關(guān)。主莖分枝數(shù)與主莖節(jié)間數(shù)、主莖葉片鮮質(zhì)量、主莖質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)，與揮發(fā)油含量呈極顯著負相關(guān)。主莖節(jié)間數(shù)與主莖葉片鮮質(zhì)量、主莖質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)。主莖節(jié)間長度與主莖葉片鮮質(zhì)量呈顯著正相關(guān)，與總黃酮含量呈極顯著負相關(guān)。主莖葉片鮮質(zhì)量與主莖質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)，與揮發(fā)油含量呈顯著負相關(guān)，與低聚糖含量呈極顯著負相關(guān)。主莖質(zhì)量與揮發(fā)油含量呈極顯著負相關(guān)，與低聚糖含量呈顯著負相關(guān)。總黃酮含量與多糖含量呈顯著負相關(guān)，與蛋白質(zhì)含量呈極顯著負相關(guān)。多糖含量與蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。以上說明，植株大部分農(nóng)藝性狀之間是相互協(xié)調(diào)、相互影響的，品質(zhì)性狀之間也存在一定的相關(guān)性，但農(nóng)藝性狀與品質(zhì)性狀之間相關(guān)性較差。

表2 宛艾種質(zhì)15個性狀的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis of 15 traits in Wan A. argyi germplasm

2.4 宛艾種質(zhì)的主成分分析

采用SPSS 20.0 對15 個性狀進行主成分分析。結(jié)果（表3）表明，可以用5 個主成分因子代表15 個性狀，貢獻率分別為28.99%、19.32%、15.35%、13.35%、8.11%，累積貢獻率為85.12%。第1、2、4 主成分主要反映農(nóng)藝性狀信息，其中，第1主成分主要反映主莖分枝數(shù)、主莖葉片鮮質(zhì)量和主莖質(zhì)量信息，且都為正向荷載因子；第2 主成分主要反映葉長、葉寬和葉柄長信息，且都為正向荷載因子；第4主成分主要反映主莖分枝高度信息，且為正向荷載因子。第3個主成分主要反映農(nóng)藝和品質(zhì)性狀信息，主莖節(jié)間長度和蛋白質(zhì)含量為較大正向荷載因子，總黃酮含量為較大負向荷載因子。第5 個主成分主要反映品質(zhì)性狀揮發(fā)油信息。

表3 主成分的因子載荷和貢獻率Tab.3 Factor loading matrix and contribution percentages of principal components

2.5 宛艾種質(zhì)的綜合評價

根據(jù)《中華人民共和國藥典》對艾葉品質(zhì)性狀的規(guī)定，桉油精不得少于0.050%、龍腦不得少于0.020%，而桉油精和龍腦是揮發(fā)油的重要成分[20]，對15 個性狀分別賦予如下權(quán)重：株高0.10、葉長0.05、葉寬0.05、葉柄長0.02、主莖分枝高度0.01、主莖分枝數(shù)0.10、主莖節(jié)間數(shù)0.03、主莖節(jié)間長度0.05、主莖葉片鮮質(zhì)量0.15、主莖質(zhì)量0.04、揮發(fā)油0.15、總黃酮0.08、多糖0.02、蛋白質(zhì)0.10 和低聚糖0.05。參考梁慧珍等[18]的方法計算隸屬函數(shù)值，獲得30 個宛艾種質(zhì)的綜合得分，其中Ai01、Ai05、Ai27、Ai04、Ai28 等5 個艾種質(zhì)的綜合得分分別為0.797、0.781、0.727、0.710、0.706，居于前五（表4）。

表4 宛艾種質(zhì)綜合得分Tab.4 Score of Wan A. argyi germplasm

2.6 宛艾種質(zhì)的聚類分析

通過離差平方和法對30 個宛艾種質(zhì)進行系統(tǒng)聚類分析，在歐式距離14.0 處，將30 個宛艾種質(zhì)聚為三大類（圖2）。第一類為優(yōu)質(zhì)型，表現(xiàn)為低稈小葉，揮發(fā)油、多糖、低聚糖和蛋白質(zhì)含量較高，包含的8 個種質(zhì)分別是Ai11、Ai12、Ai14、Ai18、Ai22、Ai23、Ai25 和Ai29；第二類為豐產(chǎn)型，表現(xiàn)為高稈大葉、多分枝、莖葉高產(chǎn)、揮發(fā)油中等，包含的8個種質(zhì)分別是Ai01、Ai02、Ai03、Ai04、Ai05、Ai07、Ai16 和Ai27；第三類介于第一類和第二類之間，表現(xiàn)為株高中等、葉片面積中等、揮發(fā)油含量中等、總黃酮含量較高，包含的14 個種質(zhì)分別是Ai06、Ai08、Ai09、Ai10、Ai13、Ai15、Ai17、Ai19、Ai20、Ai21、Ai24、Ai26、Ai28和Ai30。

圖2 宛艾種質(zhì)聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis of Wan A. argyi germplasm

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源的遺傳多樣性是新品種成功選育及應(yīng)用方面突破的關(guān)鍵，對其進行分析和保護，既拓寬了中藥材品種改良的遺傳基礎(chǔ)，也可以根據(jù)產(chǎn)業(yè)的需求變化培育新品種[21]。遺傳多樣性分析手段隨著生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)水平、細胞學(xué)水平、生化水平和分子水平。形態(tài)標(biāo)記因具有直接、簡便、易操作等優(yōu)勢一直被廣大科學(xué)家采用，廣泛應(yīng)用于糧食作物[22]、經(jīng)濟作物[23]、油料作物[24]、蔬菜[25]、水果[26]和中藥材[27]等種質(zhì)資源調(diào)查和遺傳育種。

為充分了解宛艾種質(zhì)現(xiàn)狀，對來自南陽市6 個市區(qū)縣的30 個宛艾種質(zhì)的15 個性狀進行Shannonweaver 遺傳多樣性分析，15 個性狀的H′為0.53～1.58，其中葉寬、主莖節(jié)間數(shù)、葉長、株高和葉柄長的H′居10 個農(nóng)藝性狀前列；5 個品質(zhì)性狀的H′差異稍小，揮發(fā)油含量和總黃酮含量的H′居5 個品質(zhì)性狀前列。

15 個性狀的變異系數(shù)為16.95%～160.71%，以主莖分枝高度的變異程度最高，最小的是總黃酮含量；10 個農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)平均為52.14%，5 個品質(zhì)性狀的平均變異系數(shù)為24.00%，農(nóng)藝性狀的平均變異系數(shù)大于品質(zhì)性狀，說明宛艾種質(zhì)品質(zhì)性狀間的差異較小。陳昌婕等[17]對收集的來自全國59個地區(qū)的100 個艾種質(zhì)資源進行表型多樣性分析發(fā)現(xiàn)，20 個性狀的H′為0.82～4.37。而本研究中選取的試驗材料均來自南陽市，長期的自然選擇和人為馴化導(dǎo)致材料H′低于陳昌婕等[17]的研究結(jié)果，建議宛艾開展新品種培育或遺傳改良時拓寬親本圃，多引進國內(nèi)外其他地區(qū)艾種質(zhì)資源。

性狀相關(guān)性可以通過一種性狀間接反映另一種性狀，從而提高選擇效率。本研究中15個性狀間的相關(guān)性分析主要呈現(xiàn)出3種趨勢。大部分農(nóng)藝性狀之間存在著顯著的相關(guān)性。例如株高與主莖分枝數(shù)、主莖節(jié)間數(shù)、主莖葉片鮮質(zhì)量、主莖質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)，葉長與葉寬、葉柄長呈極顯著正相關(guān)，主莖分枝數(shù)與主莖節(jié)間數(shù)、主莖葉片鮮質(zhì)量、主莖質(zhì)量、株高呈極顯著正相關(guān)。品質(zhì)性狀間也存在一定的顯著相關(guān)性。如總黃酮含量與多糖含量呈顯著負相關(guān)，與蛋白質(zhì)含量呈極顯著負相關(guān)；多糖含量與蛋白質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。農(nóng)藝性狀與品質(zhì)性狀間相關(guān)性相對較差，僅有部分農(nóng)藝性狀與品質(zhì)性狀間相關(guān)性顯著或極顯著。因此，可依據(jù)農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性分析，合理搭配目標(biāo)性狀以達到增產(chǎn)目的；但僅依據(jù)農(nóng)藝性狀并不能判斷品質(zhì)指標(biāo)的含量，改良品質(zhì)性狀前還需要進行材料的品質(zhì)檢測。

聚類分析將供試30個宛艾種質(zhì)劃分為三大類，第一類為優(yōu)質(zhì)型，表現(xiàn)為低稈小葉，揮發(fā)油、多糖、低聚糖和蛋白質(zhì)含量較高；第二類為豐產(chǎn)型，表現(xiàn)為高稈大葉、多分枝、莖葉高產(chǎn)、揮發(fā)油中等；第三類介于第一類和第二類之間，表現(xiàn)為株高中等、葉片面積中等、揮發(fā)油含量中等、總黃酮含量較高。此分類反映了所有供試材料的類型及親緣關(guān)系，為生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考，但還需結(jié)合ISSR、SSR 等分子標(biāo)記進一步進行DNA 水平的驗證[25]?；谕鸢N質(zhì)的綜合評價，明確了各類群間的特征特性和變異范圍，可為宛艾種質(zhì)資源的遺傳進化研究提供參考。

主成分分析是把原來多個具有一定相關(guān)性的變量簡化為少數(shù)幾個互不相關(guān)的綜合性狀，該方法可簡化選擇程序[28-29]。本研究通過主成分分析，提取了5 個主成分，與前人研究結(jié)果[17]相比，主成分提取值相對減少。分析原因，本研究增加了揮發(fā)油、總黃酮、低聚糖、多糖、蛋白質(zhì)等品質(zhì)性狀，如總黃酮為第3 主成分的較大荷載因子，揮發(fā)油為第5 主成分較大負向荷載因子，說明品質(zhì)性狀在宛艾種質(zhì)資源評價中具有非常重要的作用。

本研究通過對宛艾種質(zhì)農(nóng)藝和品質(zhì)性狀的多樣性分析，進一步明確了宛艾種質(zhì)表型和品質(zhì)變異的豐富程度。依據(jù)綜合得分大小，Ai01、Ai05、Ai27、Ai04、Ai28 等5 個宛艾種質(zhì)在產(chǎn)量和品質(zhì)方面綜合表現(xiàn)優(yōu)異，今后既可作為宛艾新品種選育親本直接加以利用，又可作為宛艾遺傳改良中優(yōu)良基因挖掘利用的研究材料。