王敦建，焦慧文，錢 依，徐江浩，徐 皓，孫魯寧1，#a，王永慶1，#b（1.徐州醫(yī)科大學藥學院，江蘇 徐州 1004；.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床藥理研究室，南京 1009；.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普外科，南京 1009）

伊馬替尼是第一個被美國FDA批準用于胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumors，GIST）的酪氨酸激酶抑制劑，該藥可顯著延長晚期GIST患者的無復發(fā)生存期[1]。伊馬替尼被吸收進入血液循環(huán)后，在血漿中以結合型與游離型藥物存在，其中結合型藥物在體內(nèi)主要與白蛋白（albumin，ALB）、球蛋白（globulin，GLB）和α1-酸性糖蛋白（alpha-1-acid glycoprotein，AGP）結合，而只有游離型藥物才是伊馬替尼發(fā)揮藥理作用的重要部分[2]。伊馬替尼的主要代謝物為N-去甲基伊馬替尼，兩者具有相似的生物活性和效應，且與體內(nèi)結合蛋白均具有較高的親和力[3-4]。藥物蛋白結合率的微小變化可能會對藥物游離濃度產(chǎn)生顯著影響，進而通過濃度-效應關系影響其藥理作用[5]。因此，測定體內(nèi)藥物的蛋白結合率就顯得尤為重要。

雖然國內(nèi)外已有同時測定伊馬替尼及其代謝物的報道，但樣品處理方法較繁瑣，靈敏度不高，檢測范圍不符合臨床要求，且大多采用超濾法[6-8]，該方法存在藥物容易和超濾裝置發(fā)生非特異性結合的缺點。目前也尚未有研究報道伊馬替尼及其代謝物與不同蛋白的結合情況。為此，本研究建立了平衡透析法結合液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法測定伊馬替尼及其代謝物（N-去甲基伊馬替尼）與不同蛋白結合率的方法，并同法檢測GIST患者血漿中兩者的游離藥物濃度，旨在為伊馬替尼的安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有1290 Infinity型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），AB-SCIEX API 4000型串聯(lián)四極桿質譜儀（美國Applied Biosystem公司），Stratos型高速冷凍離心機、Single-Use RED Plate with Inserts型快速平衡透析裝置（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

伊馬替尼對照品（純度98%，批號LPC0P57）、N-去甲基伊馬替尼對照品（純度98%，批號LN90O52）均購自北京百靈威科技有限公司；伊馬替尼-d8（內(nèi)標，純度98.7%，批號2-AJK-132-1）購自加拿大Toronto Research Chemicals公司；ALB（純度20%，批號S20170005）購自德國CSL Behring GmbH公司；GLB（純度5%，批號S19993042）購自成都蓉生藥業(yè)有限公司；AGP（純度≥99%，批號SLBJ6840V）購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖 溶 液（phosphate buffer saline，PBS，pH 7.2，批 號20012027）購自美國Gibco公司；甲醇、乙酸、乙腈均為色譜純，乙酸銨為分析純，水為去離子純化水。

1.3 血漿來源

空白血漿由南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血庫提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與質譜條件

2.1.1 色譜條件 以Agilant ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）為色譜柱，以乙腈-10 mmol/L乙酸銨（含0.1%乙酸）溶液（77∶23，V/V）為流動相；柱溫為35 ℃；流速為0.5 mL/min；進樣量為1.0 μL；分析時間為2.5 min。

2.1.2 質譜條件 離子源為電噴霧離子源；監(jiān)測方式為多反應監(jiān)測；采集模式為正離子；離子化電壓為5 500 V；離子源溫度為550℃；霧化氣壓為45 psi；渦輪氣壓為55 psi；氣簾氣壓為 35 psi；碰撞氣壓為 10 psi；用于定量分析的離子對分別為m/z494.4→394.2（伊馬替尼）、m/z480.4→394.2（N-去甲基伊馬替尼）、m/z502.4→394.2（內(nèi)標）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 伊馬替尼對照品溶液及其代謝物溶液 精密稱取伊馬替尼對照品10.22 mg（經(jīng)純度換算為10.02 mg）、N-去甲基伊馬替尼對照品5.13 mg（經(jīng)純度換算為5.03 mg），分別置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇-水（1∶1，V/V）溶解并定容，混勻，制成質量濃度為1.00 mg/mL的伊馬替尼對照品溶液和0.503 mg/L的代謝物溶液，于-40℃冰箱保存。

2.2.2 內(nèi)標溶液 取伊馬替尼-d8 0.50 mg，置于10 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度為50.0 μg/mL的內(nèi)標儲備液；取內(nèi)標儲備液適量，用甲醇稀釋至所需質量濃度即可。

2.2.3 標準曲線樣品溶液和質控樣品溶液 取“2.2.1”項下伊馬替尼對照品溶液及其代謝物溶液適量，用甲醇稀釋后，各取2.5μL，加入空白血漿50μL，渦旋混勻，制成伊馬替尼質量濃度分別為50.0、100、250、500、1 000、3 000、4 500、5 000 ng/mL，代謝物質量濃度分別為25.0、50.0、125、250、500、1 500、2 250、2 500 ng/mL的系列標準曲線血漿樣品溶液，以及伊馬替尼質量濃度分別為50.0、120、750、4 000 ng/mL，代謝物質量濃度分別為25.0、60.0、375、2 000 ng/mL的質控血漿樣品溶液。取PBS 100μL，同法制備伊馬替尼及其代謝物質量濃度分別均為2.00、5.00、10.0、20.0、40.0、120、180、200 ng/mL的系列標準曲線PBS樣品溶液，以及質量濃度分別均為2.00、4.80、30.0、160 ng/mL的質控PBS樣品溶液。

2.3 樣本的預處理

2.3.1 血漿樣本的預處理 取血漿樣本50μL、甲醇2.5μL，渦旋混勻，加入100 ng/mL的內(nèi)標溶液300μL，渦旋后于4℃下以16 000 r/min離心15 min，取上清液100μL，置于1.5 mL離心管中，加水900μL，渦旋混勻，取上清液進樣分析。

2.3.2 PBS樣本的預處理 取PBS樣本100μL、甲醇2.5μL，渦旋混勻，加入10.0 ng/mL的內(nèi)標溶液300μL，渦旋后于4℃下以16 000 r/min離心15 min，取上清液進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察 分別取PBS、空白血漿、伊馬替尼（50.0 ng/mL）及其代謝物（25.0 ng/mL）的標準曲線血漿樣品溶液、患者血漿樣本適量，按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄色譜圖，詳見圖1（PBS和空白血漿圖略）。由圖1可知，待測成分和內(nèi)標的保留時間分別為1.48、1.26、1.43 min，各峰峰形良好，無雜峰干擾，空白血漿中的小分子內(nèi)源性物質及PBS對測定無干擾，表明本方法專屬性良好。

圖1 伊馬替尼及其代謝物、內(nèi)標的典型色譜圖

2.4.2 線性關系考察 取“2.2.3”項下標準曲線樣品溶液，按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測成分質量濃度為橫坐標（x）、待測成分與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標（y）進行線性回歸（權重系數(shù)為1/C2）。結果顯示，血漿樣品中伊馬替尼的回歸方程為y＝0.002 00x+0.002 30（r＝0.998 3），代謝物的回歸方程為y＝0.000 620x+0.000 757（r＝0.997 1）；PBS樣品中伊馬替尼的回歸方程為y＝0.003 67x+0.001 64（r＝0.998 4），代謝物的回歸方程為y＝0.003 46x+0.001 77（r＝0.999 0）。這表明血漿樣品中伊馬替尼及其代謝物的檢測質量濃度線性范圍分別為50.0～5 000、25.0～2 500 ng/mL，定量下限分別為50.0、25.0 ng/mL；PBS樣品中線性范圍均為2.00～200 ng/mL，定量下限均為2.00 ng/mL。

2.4.3 準確度和精密度試驗 取“2.2.3”項下質控血漿樣品溶液和質控PBS樣品溶液，每濃度各5份，于同日內(nèi)按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。以實測濃度與理論濃度進行比較，用相對誤差（relative error，RE）考察準確度。結果顯示，各樣品的日內(nèi)、日間RSD均不高于12.9%，RE為-6.3%～3.5%，符合生物樣品定量分析的要求[5]。

2.4.4 提取回收率與基質效應考察 取“2.2.3”項下質控血漿樣品溶液（伊馬替尼120、750、4 000 ng/mL，代謝物60.0、375、2 000 ng/mL），每濃度各6份，按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積（A1）。取空白血漿適量，共6份，按“2.3”項下方法預處理后，分別加入伊馬替尼對照品溶液和代謝物溶液使其質量濃度與上述質量濃度對應，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積（A2）。同時按2020年版《中國藥典》（四部）[5]要求，配制伊馬替尼質量濃度分別120、4 000 ng/mL，代謝物質量濃度分別為60.0、2 000 ng/mL的低、高質量濃度基質效應樣本溶液，每濃度各6份，按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積（A3）。按流動相比例制備與上述濃度對應的伊馬替尼及其代謝物對照溶液，每濃度各6份，按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積（A4）。提取回收率＝A1/A2×100%，基質因子＝A3/A4×100%。結果顯示，伊馬替尼及其代謝物、內(nèi)標的平均提取回收率分別 為 89.2%～102.0%（RSD≤12.8%）、88.8%～99.7%（RSD≤14.3%）、99.0%（RSD＝8.8%），平均基質因子分別 為 98.2%～103.3%（RSD≤4.6%）、99.8%～101.1%（RSD≤6.1%）、107.0%（RSD＝11.7%），符合生物樣品定量分析的要求[5]。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.2.3”項下方法配制伊馬替尼質量濃度分別為120、4 000 ng/mL，代謝物質量濃度分別為60.0、2 000 ng/mL的質控血漿樣品溶液，每濃度各12份，各取3份分別于室溫放置20 h、4℃自動進樣器放置20 h、冷凍（-70℃）長期保存、-70℃反復凍融3次后，按“2.3”項下方法預處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄峰面積。以實測濃度與理論濃度進行比較，用RE考察穩(wěn)定性。結果顯示，伊馬替尼及其代謝物濃度的RSD均不高于8.3%（n＝3），RE為-7.4%～8.5%，表明待測成分在上述各種條件下穩(wěn)定性良好。

2.4.6 殘留考察 取“2.2.3”項下伊馬替尼及其代謝物質量濃度分別為5 000、2 500 ng/mL的標準曲線血漿樣品溶液，按“2.3”項下方法預處理，配制定量上限血漿樣本溶液；另取空白血漿50 μL，按“2.3”項下方法預處理，配制空白血漿樣本；再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，考察殘留效應，重復循環(huán)5次。結果顯示，方法無殘留，不影響后續(xù)樣本的測定。

2.5 平衡透析實驗

2.5.1 蛋白結合率檢測樣本的制備 取“2.2.1”項下伊馬替尼對照品溶液及其代謝物溶液適量，用甲醇稀釋，得伊馬替尼質量濃度分別為120、4 000 ng/mL，代謝物質量濃度分別為60、2 000 ng/mL的蛋白結合率工作溶液。同時將ALB（200 g/L）用PBS稀釋至45.0 g/L；將AGP（10.0 g/L）用PBS稀釋至0.100 g/L；將GLB（50.0 g/L）用PBS稀釋至25.0 g/L。取上述不同質量濃度的蛋白溶液50μL和不同質量濃度的蛋白結合率工作溶液2.5μL，置于1.5 mL塑料離心管中，混勻，制成3種不同蛋白結合率檢測樣本。

2.5.2 不同蛋白溶液結合率的測定 在一次性平衡透析板的紅色和白色孔中分別加入蛋白結合率檢測樣本或待測血漿樣本200μL、PBS 350μL，用密封帶覆蓋裝置，以800 r/min室溫渦旋2 h，分別從兩孔中吸出樣本，進行如下檢測：取“2.5.1”項下蛋白結合率檢測樣本，按“2.3”項下方法處理，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，計算樣本濃度和蛋白結合率：蛋白結合率＝（樣本濃度-PBS濃度）/樣本濃度×100%。測定3次，取平均值。使用SPSS 26.0軟件，采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析（下同）。結果顯示，與低濃度伊馬替尼（120 ng/mL）及其代謝物（60 ng/mL）比較，高濃度伊馬替尼（4 000 ng/mL）及其代謝物（2 000 ng/mL）與AGP、GLB的血漿蛋白結合率顯著提高（P＜0.05），但與ALB的血漿蛋白結合率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1 伊馬替尼及其代謝物與不同蛋白的結合率測定結果（n＝3）

2.5.3 不同質量濃度伊馬替尼及其代謝物與空白血漿蛋白結合率的測定 取“2.2.3”項下質控血漿樣品溶液（伊馬替尼低、中、高質量濃度分別為120、750、4 000 ng/mL，代謝物質量濃度分別為60、375、2 000 ng/mL），按“2.5.2”項下方法檢測蛋白結合率并進行統(tǒng)計學分析。結果顯示，中濃度伊馬替尼及其代謝物的血漿蛋白結合率與低濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高濃度伊馬替尼及其代謝物的血漿蛋白結合率顯著低于低、中濃度（P＜0.01）。結果見表2。

表2 不同質量濃度伊馬替尼及其代謝物與空白血漿的蛋白結合率測定結果（n＝3）

2.6 患者血漿中的蛋白結合率測定

2.6.1 納入與排除標準 本研究的納入標準為：（1）經(jīng)病理組織學證實為GIST；（2）接受腫瘤完整切除術且病理證實切緣陰性；（3）之前未服用過伊馬替尼；（4）GIST切除術后風險分級為中高度復發(fā)風險；（5）美國東部腫瘤協(xié)作組評分為0～2，重要臟器功能正常；（6）年齡為18～75歲；（7）所有患者均知情同意且簽署了知情同意書。本研究的排除標準為：（1）活動性感染者；（2）妊娠期或哺乳期婦女；（3）嚴重臟器功能不全或丙氨酸轉氨酶/天冬氨酸轉氨酶超過正常值上限3倍者；（4）本研究開始前4周或參加本研究的同時又參加了其他臨床研究者。

2.6.2 資料來源 本研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查批準，審查號為2013-SR-142。選擇該院2014年12月-2017年9月收治的GIST患者64例，其中男性33例、女性31例，平均年齡（54.3±11.8）歲。所有患者均接受伊馬替尼400 mg/d治療至少4周。

2.6.3 患者血漿中蛋白結合率的測定 采集所有患者處于穩(wěn)態(tài)時的谷濃度血漿樣本，按“2.5.2”項下方法檢測血漿蛋白結合率。結果顯示，伊馬替尼及其代謝物的平均血漿蛋白結合率分別為（99.0±0.3）%、（99.2±0.3）%。使用SPSS 26.0軟件，經(jīng)Pearson相關性分析，結果顯示，伊馬替尼及其代謝物的總濃度越大，其游離濃度越大（r分別為0.800 4、0.682 0，P均小于0.05），血漿蛋白結合率越低（r分別為-0.298 5、-3.332 3，P均小于0.05）。結果見圖2。

圖2 患者血漿中伊馬替尼及其代謝物的總濃度和游離濃度

3 討論

血漿蛋白結合率是藥動學的重要參數(shù)，可以影響藥物的作用時間和強度[9]，已成為藥學領域的研究熱點之一。目前，測定體內(nèi)藥物游離濃度的方法主要有超濾法、超速離心法、平衡透析法[10]，其中平衡透析法最常用，具有操作簡便、分析成本低、藥物在設備上非特異性吸附少等特點[11]。

本課題組前期考察了不同有機相（乙腈、甲醇）對色譜峰峰形和響應的影響，結果發(fā)現(xiàn)，兩種試劑對色譜峰峰形和響應的影響相差無幾，但乙腈的沉淀效果更佳，故選擇乙腈為有機相。同時還考察了不同水相[10 mmol/L乙酸銨溶液、10 mmol/L乙酸銨（含0.1%乙酸）溶液]的響應情況，結果發(fā)現(xiàn)，雖然以10 mmol/L乙酸銨溶液為水相時，可保持水相的穩(wěn)定性和保留時間的重現(xiàn)性，但加入0.1%乙酸后，可增強電離和質譜響應，提高檢測靈敏度，故選擇乙腈-10 mmol/L乙酸銨（含0.1%乙酸）溶液為流動相。本課題組前期還發(fā)現(xiàn)，當流速為0.5 mL/min時，待測成分可獲得合適的保留時間；并且樣品的制備為簡單的蛋白質沉淀過程，這有效避免了復雜的萃取過程；此外，等度洗脫程序為分析提供了穩(wěn)定的基線和恒定的電離效率，實現(xiàn)了生物樣本的高通量分析。另有研究認為，同位素內(nèi)標法能極大降低離子化效應，準確率更高[12]，因此本研究選擇伊馬替尼-d8為內(nèi)標。

本研究結果顯示，伊馬替尼及其代謝物與ALB的蛋白結合率較高，且高濃度伊馬替尼及其代謝物與AGP、GLB的血漿蛋白結合率顯著高于低濃度，但與ALB的蛋白結合率比較，差異無統(tǒng)計學意義。這提示伊馬替尼及其代謝物與ALB的結合可能屬于飽和結合，此時若再增加藥物劑量，游離藥物濃度會不成比例地增加，甚至造成患者中毒，因此在臨床使用過程中應引起重視，尤其是患者在服用競爭同一蛋白位點的藥物時，需嚴密監(jiān)測體內(nèi)血藥濃度的變化。伊馬替尼及其代謝物與患者血漿的蛋白結合率結果顯示，伊馬替尼及其代謝物的總濃度越大，其游離濃度越大，血漿蛋白結合率越低，這可能是由于伊馬替尼及其代謝物與體內(nèi)蛋白的結合接近飽和狀態(tài)，隨著藥物濃度的增加，游離藥物占給藥量的比例增大。

綜上所述，本研究成功建立了測定伊馬替尼及其代謝物血漿蛋白結合率的方法；GIST患者伊馬替尼及其代謝物的血漿蛋白結合率與藥物濃度呈負相關。