李燕，王濱，王慧凱，高新富，宮凱凱，高俊玲，丁長玲（.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 濱州 5660；.濱州市中醫(yī)院康復(fù)科，山東 濱州 5660；.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，山東 濱州 5660；4.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院國家藥物臨床試驗機構(gòu)，山東 濱州 5660）

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，桂枝為樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl的干燥嫩枝。當(dāng)歸行氣養(yǎng)血，與桂枝溫陽化氣相須為用，可除寒濕、止痹痛[1]。痹證是由風(fēng)、寒、濕侵襲機體而致脈絡(luò)閉阻，久之滯于血脈經(jīng)絡(luò)，從而引起的以肢體關(guān)節(jié)及肌肉酸痛、麻木、屈伸不利等為主癥的一類病癥，其治療以溫補氣血為主，核心用藥包括桂枝、當(dāng)歸、炙甘草等藥材[2-3]。有學(xué)者通過分析古今醫(yī)案中桂枝類方劑的配伍規(guī)律發(fā)現(xiàn)，該類方劑治療關(guān)節(jié)疼痛的核心藥對包括桂枝-當(dāng)歸、桂枝-附子、桂枝-甘草[1]。

當(dāng)歸、桂枝的主要藥效物質(zhì)為揮發(fā)油[4-5]。揮發(fā)油在常溫下不穩(wěn)定，且易在制劑過程中損失，而開發(fā)成適宜劑型則可有助于提高揮發(fā)油的穩(wěn)定性[6]。自微乳載藥系統(tǒng)（self-microemulsion drug delivery system，SMEDDS）由油相、乳化劑和助乳化劑以適宜比例混勻后自發(fā)形成，具熱力學(xué)穩(wěn)定、黏度低、高速離心、無相分離等特點，可增大揮發(fā)油的溶解度，提高其穩(wěn)定性[7]。

“藥輔合一”即“藥之為輔”，指部分中藥可通過利用其形、色、氣、味等理化特性和助懸、分散、吸附、助磨、增稠等功能特性來作為輔料以輔助制劑的成型與穩(wěn)定[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸、桂枝飲片等量混勻后提取的揮發(fā)油（以下簡稱“歸桂混合揮發(fā)油”）可作為SMEDDS的油相。基于此，本研究擬將歸桂混合揮發(fā)油同時作為油相和模型藥物，制備歸桂自微乳載藥系統(tǒng)（Angelica-CinnamomumSMEDDS，AC-SMEDDS），優(yōu)化其處方并表征所得制劑，為研發(fā)相關(guān)新劑型和擴大中藥揮發(fā)油應(yīng)用途徑提供思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20AT型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）、HT7700型透射電鏡（日立Hitachi公司）、Matersizer 3000型激光粒度分析儀（英國Malvern有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

當(dāng)歸飲片（批號20210310）、桂枝飲片（批號20210123）均購自亳州市甄藥源中藥科技有限公司，經(jīng)濱州市中醫(yī)院婦產(chǎn)科王君教授鑒定分別為傘形科植物當(dāng)歸A.sinensis（Oliv.）Diels的干燥根和樟科植物肉桂C.cassiaPresl的干燥嫩枝。

藁本內(nèi)酯對照品（批號B20492，純度≥98%）、桂皮醛對照品（批號B21481，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；蓖麻油聚氧乙烯（40）醚（EL-40，批號090000001100）購自臨沂綠森化工有限公司；氫化蓖麻油聚氧乙烯（40）醚（CO-40，批號089618007420）、聚乙二醇400（PEG400，批號089790003160）均購自山東優(yōu)索化工科技有限公司；聚氧乙烯40氫化蓖麻油（RH-40，批號100589021004）購自江蘇省海安市石油化工廠；丙二醇（PG，批號100420190303）、聚山梨酯80（TW-80，批號101720191103）均購自湖南爾康制藥股份有限公司；乙醇（批號20200929）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 歸桂混合揮發(fā)油和當(dāng)歸、桂枝揮發(fā)油的制備

將當(dāng)歸、桂枝飲片粉碎，取粗粉等量混勻，加10倍量水，浸泡100 min，以水蒸氣蒸餾法提取5 h[9]，即得歸桂混合揮發(fā)油（得率為0.417%）。同法制得當(dāng)歸揮發(fā)油、桂枝揮發(fā)油（得率分別為0.381%、0.472%）。

2.2 AC-SMEDDS、當(dāng)歸揮發(fā)油-SMEDDS、桂枝揮發(fā)油-SMEDDS的制備

取處方量的歸桂混合揮發(fā)油，置于含混合乳化劑（乳化劑和助乳化劑以一定質(zhì)量比混合）的具塞西林瓶中，以400 r/min攪拌至形成均勻、澄清且流動性好的淡黃色溶液，即得AC-SMEDDS。取處方量的當(dāng)歸揮發(fā)油或桂枝揮發(fā)油，同法處理，即得當(dāng)歸揮發(fā)油-SMEDDS、桂枝揮發(fā)油-SMEDDS。

2.3 藁本內(nèi)酯的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜條件參考文獻[10]：以Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-水（63∶37，V/V）為流動相；柱溫為25 ℃；流速為1 mL/min；檢測波長為326 nm；進樣量為10 μL。

2.3.2 溶液的制備 （1）取藁本內(nèi)酯對照品20 mg，用乙腈溶解并定容于2 mL量瓶中，制得藁本內(nèi)酯質(zhì)量濃度為10 mg/mL的對照品儲備液。（2）取“2.2”項下AC-SMEDDS（乳化劑為EL-40，助乳化劑為乙醇，兩者質(zhì)量比為9∶1）適量，以10 000 r/min離心5 min，取上清液0.1 g，加乙腈定容于10 mL量瓶中，即得供試品溶液。（3）取“2.2”項下桂枝揮發(fā)油-SMEDDS適量，按“2.3.2（2）”項下方法制備陰性溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察 參照2020年版《中國藥典》（四部）相關(guān)要求進行專屬性、線性關(guān)系考察和精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗[9]。結(jié)果顯示，供試品中藁本內(nèi)酯色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且陰性溶液對測定無干擾（圖略）；藁本內(nèi)酯的回歸方程為y＝18 283.01x-329 124.40（R2＝0.999 7），其檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為25～125 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（12 h）、重復(fù)性、加樣回收率試驗的RSD均小于2%。

2.4 桂皮醛的含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜條件參考文獻[11]：以Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（34∶66，V/V）為流動相；柱溫為25℃；流速為1 mL/min；檢測波長為290 nm；進樣量為10 μL。

2.4.2 溶液的制備 （1）取桂皮醛對照品20 mg，用乙腈溶解并定容于2 mL量瓶中，制得桂皮醛質(zhì)量濃度為10 mg/mL的對照品儲備液。（2）供試品溶液的配制同“2.3.2（2）”項。（3）取當(dāng)歸揮發(fā)油-SMEDDS適量，按“2.3.2（3）”項下方法制備陰性溶液。

2.4.3 方法學(xué)考察 參照2020年版《中國藥典》（四部）相關(guān)要求進行專屬性、線性關(guān)系考察和精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗[9]。結(jié)果顯示，供試品中桂皮醛色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且陰性溶液對測定無干擾（圖略）；桂皮醛的回歸方程為y＝61 936.90x+906 046.75（R2＝0.999 8），其檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為20～140 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（8 h）、重復(fù)性、加樣回收率試驗的RSD均小于2%。

2.5 乳化劑和助乳化劑的篩選

2.5.1 乳化劑和助乳化劑的初篩 取“2.1”項下歸桂混合揮發(fā)油0.5 g，與不同乳化劑（EL-40、TW-80、CO-40、RH-40）或助乳化劑（乙醇、PEG400、PG）1 g混合，分別置于具塞西林瓶中，渦旋混勻24 h，以10 000 r/min離心5 min，取上清液0.1 mL，用乙腈定容于10 mL量瓶中，即得歸桂混合揮發(fā)油溶于不同輔料的樣品溶液。取上述樣品溶液，分別按“2.3”“2.4”項下方法測定藁本內(nèi)酯、桂皮醛的含量并按下式計算兩者溶解度：溶解度＝藁本內(nèi)酯或桂皮醛的質(zhì)量（mg）/溶劑體積（mL）。取溶解度大者為目標(biāo)輔料，每份樣品重復(fù)3次。結(jié)果（表1）顯示，藁本內(nèi)酯在各輔料中的溶解度依次為乙醇＞PEG400＞EL-40＞TW-80＞CO-40＞PG＞RH-40，桂皮醛在各輔料中的溶解度依次為EL-40＞TW-80＞乙醇＞RH-40＞PEG400＞CO-40＞PG，故初步確定EL-40、TW-80為待選乳化劑，乙醇、PEG400為待選助乳化劑。

表1 歸桂混合揮發(fā)油在不同輔料中的溶解度（±s，n＝3）

表1 歸桂混合揮發(fā)油在不同輔料中的溶解度（±s，n＝3）

輔料EL-40 TW-80 RH-40 CO-40乙醇PEG400 PG藁本內(nèi)酯/（mg/mL）5.32±0.04 4.19±0.02 3.86±0.02 4.17±0.01 7.62±0.05 5.76±0.02 3.90±0.01桂皮醛/（mg/mL）2.14±0.02 1.77±0.01 1.47±0.01 0.78±0.01 1.65±0.02 1.32±0.01 0.75±0.01

2.5.2 乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比的篩選 固定歸桂混合揮發(fā)油、混合乳化劑[乳化劑和助乳化劑的質(zhì)量比分別為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5]的總質(zhì)量為1 g，渦旋混勻，加水100 mL，考察歸桂混合揮發(fā)油與混合乳化劑質(zhì)量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5時各體系的分散情況，繪制歸桂混合揮發(fā)油/EL-40/乙醇、歸桂混合揮發(fā)油/EL-40/PEG400、歸桂混合揮發(fā)油/TW-80/乙醇、歸桂混合揮發(fā)油/TW-80/PEG400的偽三元相圖（可形成自微乳的區(qū)域用黑色表示）。結(jié)果（圖1）顯示，當(dāng)以EL-40為乳化劑、乙醇為助乳化劑時，自微乳區(qū)域面積最大。同時筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳化劑和助乳化劑的質(zhì)量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6時，只能形成白色的乳濁液體系；而當(dāng)兩者質(zhì)量比為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5時，則可形成均一、透明的微乳液。因此，本研究確定EL-40為乳化劑、乙醇為助乳化劑，并結(jié)合前期預(yù)實驗結(jié)果進一步將兩者質(zhì)量比的優(yōu)化范圍縮小為15∶2～9∶1。

圖1 不同體系的偽三元相圖

2.6 AC-SMEDDS處方的優(yōu)化

結(jié)合前期研究和上述實驗結(jié)果，本研究進一步以油相（即歸桂混合揮發(fā)油）占比（A）、乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比（B）為因素，以平均粒徑（Y1）、揮發(fā)油含量（即揮發(fā)油在AC-SMEDDS中的質(zhì)量百分比，Y2）、乳化時間（Y3）為指標(biāo)[12]，采用中心復(fù)合設(shè)計-效應(yīng)面（central composite design-response surface methodology，CCD）法優(yōu)化處方，具體因素與水平見表2。采用層次分析法構(gòu)建判斷矩陣并利用SPSSAU軟件計算得Y1、Y2、Y3的權(quán)重系數(shù)分別為0.29、0.57、0.14，同時得最大特征根為3，一致性比例因子為0（＜0.01），提示權(quán)重系數(shù)賦值合理[13]。按下式對各指標(biāo)進行歸一化處理：平均粒徑的歸一值（Y11）＝（200-Y1）/200，揮發(fā)油含量的歸一值（Y21）＝Y(jié)2/31，乳化時間的歸一值（Y31）＝（30-Y3）/30（式中，各常數(shù)項為Y1～Y3實測最大值經(jīng)取整后所得）；再按下式計算綜合評分（Y）：Y＝Y(jié)11×0.29+Y21×0.57+Y31×0.14，Y越大表示處方組成越理想[14]。結(jié)果見表3。

表2 AC-SMEDDS處方優(yōu)化的因素與水平

表3 AC-SMEDDS處方優(yōu)化的實驗設(shè)計與結(jié)果

使用Design-Expert 8.0.6軟件回歸擬合，得二元二次回歸方程為Y＝0.610+0.005A+0.023B-0.001AB+0.026A2+0.007B2。同時，對其進行方差分析，結(jié)果（表4）顯示，模型的P小于0.000 1，提示其擬合良好；失擬項的P為0.069 0，提示殘差對優(yōu)化結(jié)果的影響不明顯；A、B、A2、B2均為顯著項（P＜0.05），表明考察因素與指標(biāo)之間并非簡單的線性關(guān)系。此外，本模型的精密度良好（R2＝0.975 5）、變異系數(shù)較低（0.92%），可較好地反映因素A、B與綜合評分之間的關(guān)系。

表4 方差分析結(jié)果

根據(jù)模型繪制效應(yīng)面圖和等高線圖，考察兩因素的交互作用。效應(yīng)面圖（圖2A）顯示，綜合評分隨乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比的增加呈非線性升高的趨勢，且曲面較為平滑；隨著油相占比的增加，綜合評分先降低后升高；等高線圖（圖2B）顯示，其曲線接近圓形，表明因素A、B之間的交互作用不明顯。

圖2 兩因素交互作用的效應(yīng)面圖和等高線圖

采用Design-Expert 8.0.6軟件求解上述二元二次方程，得模型預(yù)測的最優(yōu)處方為油相占比29.39%，乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比439∶50?？紤]到工業(yè)生產(chǎn)實際，本研究最終確定最優(yōu)處方為油相占比30%，乳化劑（EL-40）與助乳化劑（乙醇）質(zhì)量比9∶1。按此條件平行制備3批AC-SMEDDS，測得平均揮發(fā)油含量為30%，平均粒徑為（148.33±1.53）nm，乳化時間為（18.44±0.11）s；3批樣品的綜合評分為0.68，與預(yù)測值（0.70）的相對誤差為2.86%，提示該處方可行。

2.7 AC-SMEDDS的質(zhì)量評價

2.7.1 外觀和微觀形態(tài)觀察 按“2.6”項下最優(yōu)處方制備AC-SMEDDS，觀察其外觀和微觀形態(tài)。結(jié)果顯示，AC-SMEDD為淡黃色液體，略黏稠，均勻、澄清且流動性好（圖3A）；加水稀釋后，所得微乳液呈半透明狀，均勻，帶淡藍色乳光（圖3B）；將上述微乳液滴于碳膜銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸溶液復(fù)染，置于透射電鏡下觀察，可見其微粒呈邊緣半透明的球形，無粘連（圖3C）。

圖3 AC-SMEDDS的外觀和微觀形態(tài)

2.7.2 載藥量和包封率的測定 取按最優(yōu)處方所制的AC-SMEDDS 0.1 g，用乙腈定容于2 mL量瓶中，按“2.3”“2.4”項下方法測定其中藁本內(nèi)酯、桂皮醛的含量并計算載藥量：載藥量＝制劑所含藁本內(nèi)酯（或桂皮醛）的質(zhì)量（mg）/制劑總質(zhì)量（g）[9]。另取上述AC-SMEDDS 0.1 g，用水定容于2 mL量瓶中，以10 000 r/min離心5 min，取上清液0.4 mL，用乙腈定容于2 mL量瓶中，按“2.3”“2.4”項下方法測定其中藁本內(nèi)酯、桂皮醛的含量并計算包封率：包封率＝微乳制劑包封的藁本內(nèi)酯（或桂皮醛）的質(zhì)量/微乳制劑中包封與未包封藁本內(nèi)酯（或桂皮醛）的總量×100%[9]。樣品重復(fù)測定3次。結(jié)果顯示，分別以藁本內(nèi)酯、桂皮醛計，AC-SMEDDS的載藥量為（7.58±0.03）、（4.17±0.01）mg/g，包封率為（93.25±0.01）%、（88.89±0.02）%。

2.7.3 稀釋倍數(shù)對粒徑的影響 取按最優(yōu)處方所制的AC-SMEDDS 0.1 g，分別加水稀釋50、100、200倍，渦旋混勻，用激光粒度分析儀測定粒徑，重復(fù)3次。結(jié)果顯示，各稀釋樣品的粒徑均穩(wěn)定于（149.01±1.03）nm。

2.7.4 穩(wěn)定性考察 （1）離心穩(wěn)定性考察：取按最優(yōu)處方所制的AC-SMEDDS 0.1 g，加適量水，以10 000 r/min離心5 min。此過程中，未見沉淀或油滴析出。（2）初步穩(wěn)定性考察：取按最優(yōu)處方所制的AC-SMEDDS適量，分別于4、25 ℃密封保存，再于第0、1、3、5、7天時以10 000 r/min離心5 min，觀察外觀性狀并按“2.3”“2.4”項下方法測定其中藁本內(nèi)酯、桂皮醛含量。每樣品重復(fù)測定3次。結(jié)果顯示，在4或25℃下放置7 d內(nèi)，各樣品均為均勻、澄清的淡黃色液體，離心未見沉淀或油滴析出；藁本內(nèi)酯、桂皮醛含量分別為（7.58±0.91）、（4.17±1.14）mg/g。

3 討論

藁本內(nèi)酯、桂皮醛為當(dāng)歸、桂枝揮發(fā)油發(fā)揮抗菌消炎作用的主要藥效成分[4-5]，將兩者作為AC-SMEDDS的指標(biāo)性成分可全面反映制劑的質(zhì)量?？紤]到兩者均為熱不穩(wěn)定成分，為驗證水蒸氣蒸餾法提取的可行性，本研究前期按“2.1”項下方法平行提取歸桂混合揮發(fā)油3次，測得提取率的RSD為0.88%，藁本內(nèi)酯、桂皮醛含量的RSD分別為0.71%、0.56%，提示水蒸氣蒸餾法穩(wěn)定、可行。

選擇適宜的輔料是成功制備SMEDDS的關(guān)鍵。藥用微乳所用輔料要求毒性低、乳化效果好，且親水親油平衡值高的乳化劑可促進微乳的形成[15]。本課題組前期在預(yù)實驗中分別考察了歸桂混合揮發(fā)油與等量RH-40、EL-40、TW-80、CO-40、乙醇、PEG400、PG、甘油混合后的體系狀態(tài)，結(jié)果顯示，歸桂混合揮發(fā)油在甘油中的溶解度最低，故將該輔料剔除。

在此基礎(chǔ)上，本研究以歸桂混合揮發(fā)油為油相和模型藥物，基于“藥輔合一”理念制備了AC-SMEDDS，并對其處方進行了優(yōu)化：首先，通過測定溶解度和繪制偽三元相圖篩選出乳化劑（EL-40）和助乳化劑（乙醇），并得出兩者質(zhì)量比的優(yōu)化范圍為15∶2～9∶1。其次，以油相占比、乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比為因素，以SMEDDS穩(wěn)定性評價重要指標(biāo)（揮發(fā)油含量、粒徑、乳化時間）的綜合評分為指標(biāo)，采用CCD法優(yōu)化得其最優(yōu)處方為油相占比30%、乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比9∶1。最后，對按最優(yōu)處方所制AC-SMEDDS的質(zhì)量進行初步評價，結(jié)果顯示，以藁本內(nèi)酯、桂皮醛計，其載藥量分別為（7.58±0.03）、（4.17±0.01）mg/g，包封率為（93.25±0.01）%、（88.89±0.02）%，且樣品穩(wěn)定性良好。但由于時間有限，所制AC-SMEDDS的加速試驗和長期穩(wěn)定性試驗有待于后續(xù)完善。

綜上所述，本研究成功制備了AC-SMEDDS并優(yōu)化了其處方，所得制劑的穩(wěn)定性良好。