舒波，雷果平，袁斌（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 南充 637000；.南充市食品藥品檢驗所，四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學(xué)院藥物研究所，四川 南充 637000）

便通膠囊由肉蓯蓉、麩炒白術(shù)、枳實、桑椹、當(dāng)歸、蘆薈6味藥材組成，具有健脾益腎、潤腸通便的功效，主要用于治療脾腎不足、腸腑氣滯，或習(xí)慣性便秘、肛周疾病所致大便秘結(jié)，或排便乏力、神疲氣短、頭暈?zāi)垦?、腰膝酸軟等癥[1-2]。方中肉蓯蓉補(bǔ)腎益血、潤腸通便，麩炒白術(shù)健脾益氣，共為君藥，松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷等為肉蓯蓉的特征成分，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ等為白術(shù)的活性成分；桑椹滋陰補(bǔ)血、清利腸道，當(dāng)歸補(bǔ)血活血、潤腸通便，合為臣藥，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷為桑椹的藥效成分，阿魏酸為當(dāng)歸的主要成分[3]；枳實破氣消積、化痰散痞，蘆薈瀉下通便，共為佐藥，蕓香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷為枳實的主要成分[4]。便通膠囊現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典》（一部）[5]，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅對肉蓯蓉成分松果菊苷和蘆薈成分蘆薈苷進(jìn)行了定量控制。由于中成藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，成分間相互協(xié)同、相互制約，具有多靶點等特點，因此單一成分的測定難以有效保證療效的一致性及質(zhì)量的整體均一性。中藥質(zhì)量評價指標(biāo)的選擇應(yīng)以君藥所含成分為首選，同時兼顧臣、佐、使藥成分[6]，但阿魏酸為當(dāng)歸[3]、白術(shù)[7]和蘆薈[8]的共有成分，專屬性不強(qiáng)，且蘆薈的處方用量較小，因此本研究以君藥肉蓯蓉和麩炒白術(shù)、臣藥桑椹以及佐藥枳實中的主要成分為指標(biāo)成分。

高效液相色譜結(jié)合一測多評（HPLC-QAMS）法能有效地降低檢驗成本，解決對照品不穩(wěn)定、不易獲得等不足，已廣泛用于多指標(biāo)成分的含量測定[9]?；瘜W(xué)模式識別分析通過對多成分的定量測定結(jié)果進(jìn)行提取和降維，能挖掘出復(fù)雜數(shù)據(jù)間存在的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性，找出對質(zhì)量控制具有顯著貢獻(xiàn)的主要成分[10]?；诖?，本研究采用HPLC-QAMS法同時測定便通膠囊中蕓香柚皮苷等11個成分的含量，并進(jìn)行化學(xué)模式識別分析，篩選差異標(biāo)志物，以期為便通膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20A型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、e2695型HPLC儀（美國Waters公司）、XS105型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）、SB-1000YDTD型超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

便通膠囊（編號為S1～S15，批號分別為200112、200325、200433、200437、200443、200545、200547、201123、201126、201128、210617、210861、210872、210987、211044，規(guī)格0.35 g）購自健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。新橙皮苷對照品（批號111857-201804，純度99.4%）、毛蕊花糖苷對照品（批號111530-201914，純度95.2%）、柚皮苷對照品（批號110722-202116，純度91.7%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對照品（批號111978-201501，純度99.9%）、松果菊苷對照品（批號111670-201907，純度91.8%）和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品（批號111975-201501，純度99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；管花苷A對照品（批號PRF9091721，純度98.9%）、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷對照品（批號PRF10012104，純度98.4%）、蕓香柚皮苷對照品（批號PRF9062802，純度99.8%）、異毛蕊花糖苷對照品（批號PRF21102922，純度97.0%）和矢車菊素-3-O-蕓香糖苷對照品（批號PRF20081421，純度98.5%）均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 以Venusil XBP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～11 min，15.0%A；11～20 min，15.0%A→35.0%A；20～36 min，35.0%A→42.0%A；36～47min，42.0%A→50.0%A；47～60min，50.0%A→60.0%A；60～70 min，60.0%A→15.0%A）[11]；流速為 1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為30℃；檢測波長分別為283 nm（0～20 min，蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷）[12]、330 nm（20～36 min，松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷）[13]、520 nm（36～47 min，矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷）[14]、220 nm（47～70 min，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ）[15]。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對照品各適量，用70%甲醇制成上述各成分質(zhì)量濃度依次為0.852、0.936、1.412、1.170、0.354、0.710、0.278、0.414、0.578、0.192、0.108 mg/mL的混合對照品貯備液；取混合對照品貯備液，用70%甲醇稀釋，制得上述各成分質(zhì)量濃度依次為42.6、46.8、70.6、58.5、17.7、35.5、13.9、20.7、28.9、9.6、5.4μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取便通膠囊內(nèi)容物1.0 g，精密加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率1 000 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.1.4 專屬性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液（70%甲醇）各適量，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（圖1，陰性溶液圖略）。結(jié)果顯示，各成分峰的理論板數(shù)均不低于5 500，且分離良好；陰性溶液對含量測定無干擾。

圖1 蕓香柚皮苷等待測成分混合對照品、供試品的HPLC圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品貯備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，用70%甲醇分別稀釋至20 mL，得系列線性工作溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以各待測成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 蕓香柚皮苷等11個待測成分的回歸方程與線性范圍

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號S1），按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，蕓香柚皮苷等11個待測成分峰面積的RSD均小于2%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取便通膠囊（編號S1），共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果顯示，蕓香柚皮苷等11個待測成分含量的RSD均小于2%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置 0、2、5、9、16、24、36 h 時按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，蕓香柚皮苷等11個待測成分峰面積的RSD均小于2%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置36 h穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的便通膠囊（編號S1）內(nèi)容物0.5 g，共9份，按80%、100%、120%分別加入混合對照品溶液（蕓香柚皮苷等11個待測成分的質(zhì)量濃度依次為0.479、0.631、0.917、0.769、0.194、0.383、0.155、0.239、0.294、0.107、0.059 mg/mL），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，蕓香柚皮苷等11個待測成分的平均加樣回收率為96.95%～100.13%（RSD為0.64%～1.43%，n＝9）。

2.1.10 相對校正因子的計算 取“2.1.5”項下系列線性工作溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以毛蕊花糖苷為內(nèi)參物（毛蕊花糖苷的出峰時間居中、含量較高、質(zhì)量穩(wěn)定），按下式計算毛蕊花糖苷相對于其他成分的相對校正因子（fsi），即fsi＝?s/?i＝（Wi×As）/（Ws×Ai）。式中，As為內(nèi)參物的峰面積，Ws為內(nèi)參物的質(zhì)量濃度，Ai為待測成分的峰面積，Wi為待測成分的質(zhì)量濃度[9]。結(jié)果顯示，其他10個待測成分（順序同表1，毛蕊花糖苷除外）的平均fsi分別為0.840 0、0.757 3、0.626 7、0.702 0、2.229 4、2.760 5、1.567 8、1.161 2、3.757 3、5.157 2，RSD為0.21%～1.89%（n＝6）。

2.1.11 不同試驗條件對fsi的影響 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，分別考察不同HPLC儀（Shimadzu LC-20A型、e2695型，下同）、色譜柱（Venusil XBP C18、Cosmosil C18、Durashell C18，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm，下同）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）對fsi的影響。結(jié)果顯示，其他10個待測成分（毛蕊花糖苷除外）fsi的RSD均小于2%。

2.1.12 色譜峰定位 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，分別考察不同色譜儀、色譜柱對相對保留時間（Ris）的影響。結(jié)果顯示，其他10個待測成分（毛蕊花糖苷除外）Ris的RSD均小于2%，表明Ris法可以對目標(biāo)化合物色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位。

2.1.13 15批樣品的含量測定 取15批便通膠囊，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，分別按外標(biāo)法、HPLCQAMS法（以毛蕊花糖苷為內(nèi)參物）計算含量，每樣品平行測定3次，采用相對平均偏差（relative average deviation，RAD）考察2種方法所得結(jié)果的差異（表2）。結(jié)果顯示，2種方法所得含量測定結(jié)果的RAD均小于2%，表明2種方法的測定結(jié)果無明顯差異。

表2 蕓香柚皮苷等11種待測成分的含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）

2.2 聚類分析

將HPLC-QAMS法測得的蕓香柚皮苷等11個待測成分含量結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0軟件，以歐氏距離為測度，采用組間聯(lián)接法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)歐氏距離為10時，15批樣品可聚為3類，S1～S7為一類，S8～S10為一類，S11～S15為一類。結(jié)果見圖2。

圖2 15批樣品的聚類分析樹狀圖

2.3 主成分分析

將HPLC-QAMS法測得的蕓香柚皮苷等11個待測成分含量結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，前2個主成分的特征值分別為8.243、1.709，方差貢獻(xiàn)率分別為74.941%、15.536%，累計方差貢獻(xiàn)率為90.477%，表明前2個主成分可代表便通膠囊中90.477%的信息。蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷、管花苷A、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可以反映第一主成分的信息，矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可以反映第二主成分的信息。同時應(yīng)用SIMCA 14.1軟件建立主成分分析模型。結(jié)果顯示，模型擬合程度（R2X）為0.749，表明所建模型穩(wěn)定，S1～S7、S8～S10、S11～S15分別呈現(xiàn)一定關(guān)聯(lián)性。結(jié)果見圖3。

圖3 主成分分析得分圖

2.4 正交偏最小二乘法-判別分析

將HPLC-QAMS法測得的蕓香柚皮苷等11個待測成分含量結(jié)果導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析。結(jié)果顯示，累積解釋能力參數(shù)（R2X、R2Y）分別為0.909、0.866，預(yù)測能力參數(shù)（Q2）為0.787，均大于0.5，表明所建模型穩(wěn)定、可靠，預(yù)測能力強(qiáng)，可用于區(qū)分不同批次的便通膠囊。15批便通膠囊的含量測定結(jié)果均在95%置信區(qū)間內(nèi)，表明建立的方法可靠。結(jié)果見圖4。

圖4 15批樣品的正交偏最小二乘法-判別分析模型得分圖

變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值代表每個指標(biāo)在區(qū)分樣品時的貢獻(xiàn)程度，以VIP值＞1為標(biāo)準(zhǔn)篩選影響樣品質(zhì)量的差異標(biāo)志物[10]。結(jié)果顯示，矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷和毛蕊花糖苷是影響便通膠囊質(zhì)量的差異標(biāo)志物。結(jié)果見圖5。

圖5 11個成分的VIP圖

3 討論

本課題組前期分別考察了不同提取溶劑（水、甲醇、50%甲醇、70%甲醇、70%乙醇）、提取時間（20、30、40、50 min）、提取方式（超聲提取、回流提?。┑纫蛩貙μ崛⌒Ч挠绊懀Y(jié)果顯示，以70%甲醇為提取溶劑時，蕓香柚皮苷等11個待測成分的色譜峰峰面積較大，故選擇提取溶劑為70%甲醇；超聲提取和回流提取的提取效率差異不明顯，因超聲提取操作簡便，故選擇超聲提??；當(dāng)超聲提取30 min時，蕓香柚皮苷等11個待測成分的含量較高，故選擇超聲時間為30 min。同時，本課題組又考察了不同流動相（乙腈-水、甲醇-水）的分離情況，結(jié)果顯示，以乙腈-水為流動相時，蕓香柚皮苷等11個待測成分的分離效果較好，但新橙皮苷色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象；進(jìn)一步又對乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%醋酸溶液進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相時，蕓香柚皮苷等11個待測成分可達(dá)到基線分離，峰形較好，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相。

含量測定結(jié)果顯示，外標(biāo)法與HPLC-QAMS法的測定結(jié)果無明顯差異；待測成分含量均存在一定批間差異，尤其以柚皮苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ及白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ等成分含量批間差異較大，同一生產(chǎn)階段的產(chǎn)品含量差異波動相對較小，這可能與制劑生產(chǎn)所用藥材批間差異小以及制劑生產(chǎn)過程質(zhì)量控制有關(guān)。

聚類分析結(jié)果顯示，15批樣品可聚為3類，S1～S7為一類，S8～S10為一類，S11～S15為一類，與主成分分析分類結(jié)果一致，其原因可能為原藥材來源及產(chǎn)地土壤、氣候、水質(zhì)等因素導(dǎo)致不同批次藥材質(zhì)量存在較大差異，提示藥品生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中應(yīng)重點關(guān)注原藥材產(chǎn)地并控制生產(chǎn)過程的操作參數(shù)，確保產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，最終達(dá)到療效的一致性。正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果顯示，矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、柚皮苷、新橙皮苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷是影響便通膠囊質(zhì)量的差異標(biāo)志物。

綜上所述，本研究建立了測定便通膠囊中蕓香柚皮苷等11種成分含量的方法，結(jié)合化學(xué)模式識別分析可用于便通膠囊的質(zhì)量控制。矢車菊素-3-O-蕓香糖苷等6種成分可能是影響便通膠囊質(zhì)量的差異標(biāo)志物。