榮華，張靜艷，劉京，張曉杰#（.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 50040；.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 6006）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)于中老年人群，常伴有運動缺陷癥狀，黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的丟失以及路易小體的形成是該疾病的典型病理特征[1]。目前，除首選外源性補充多巴胺來治療PD外，中醫(yī)藥防治PD具有獨特優(yōu)勢[2]。中醫(yī)學(xué)認為PD病機以肝腎為本，肝風(fēng)內(nèi)動為標(biāo)[3]。震顫和身體搖動是中醫(yī)藏象學(xué)說中肝風(fēng)內(nèi)動的病理表現(xiàn)，肝陽上亢證是PD的主要證型，治以補腎柔肝、潛陽熄風(fēng)[4]。以往研究采用單一的PD病理學(xué)模型，這很難體現(xiàn)抗PD中藥病證兼顧的作用特點。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯為《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中的經(jīng)典方劑，在治療肝陽上亢型PD中有著顯著效果[5]，但是其復(fù)方成分繁多，藥味之間關(guān)系作用復(fù)雜，研究難度較大。牛膝-白芍作為鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的核心藥對，在治療PD的方劑中出現(xiàn)較多，牛膝補益肝腎、引火下行，白芍養(yǎng)血濡筋、緩急止痙，兩藥成對，可奏補腎柔肝、潛陽熄風(fēng)之功[6]。本課題組前期研究結(jié)果提示，在體外實驗中牛膝和白芍的有效成分可抑制氧化應(yīng)激的發(fā)生，對多巴胺能神經(jīng)元具有協(xié)同增效的保護作用[7]?；诖耍狙芯坎捎貌∽C結(jié)合的動物模型，探討牛膝-白芍藥對對肝陽上亢型PD小鼠腦組織氧化應(yīng)激的影響，旨在為該藥對治療PD的機制研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Stratagene Mx3005P型實時熒光定量PCR儀（美國Agilent公司），ELX800型全自動酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），JY-ZY2型轉(zhuǎn)移電泳槽、JYCZ1型單垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），HT7800型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

附子、牛膝、白芍飲片（批號分別為000001294、001001502、001001168）均購于北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥科學(xué)研究院李曉明副研究員鑒定均為真品。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP，批號M0896）購于美國Sigma公司；兔源酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體（批號J5248）購于美國Santa Cruz公司；兔源硫氧還蛋白還原酶1（thioredoxin reductase 1，Trxr1）、核纖層蛋白B（lamin B）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號分別為 1、1345S、2118S）均購于美國Cell Signaling Technology公司；兔源硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting protein，Txnip）、核因子 E2相關(guān)因子 2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2，Nrf2）抗體（批號分別為ab188865、ab137550）均購于英國Abcam公司；生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、SP免疫組化法試劑盒（批號分別為00051405、0011404）均購于北京康為世紀生物科技有限公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒（批號分別為BC1315、BC0170、BC0020）均購于北京索萊寶科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計，具體見表1。

表1 Nrf 2等引物序列和擴增產(chǎn)物片段長度

1.3 動物

C57BL/6雄性小鼠，共60只，3月齡，體質(zhì)量（25±2）g，由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXF（蘇）2015-0001。本實驗方案經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會審查批準(zhǔn)，批件號為（齊）倫審〔2021〕127號。

2 方法

2.1 藥液的制備

分別取附子、牛膝、白芍飲片，按照傳統(tǒng)煎藥法制備附子、牛膝、白芍、牛膝-白芍藥對煎液，質(zhì)量濃度分別為0.20、0.33、0.17、0.50 g/mL（以生藥量計，下同）。鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯參考文獻[8]制備，質(zhì)量濃度為1.67 g/mL，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物分組、造模及給藥

將小鼠隨機分為正常對照組、模型組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組（25 g/kg）、牛膝組（4.5 g/kg）、白芍組（2.3 g/kg）及牛膝-白芍藥對組（6.8 g/kg），每組10只。除正常對照組外，其他組采用附子煎液（4 g/kg）灌胃給藥4周復(fù)制肝陽上亢型小鼠模型；附子灌胃結(jié)束后，腹腔注射MPTP（25 mg/kg）7 d，復(fù)制肝陽上亢型PD小鼠模型。在每次注射MPTP1 h后，除正常對照組和模型組小鼠灌胃生理鹽水外，其余各組小鼠分別灌胃對應(yīng)藥液，在MPTP腹腔注射7 d后，繼續(xù)給予7 d，給藥劑量參考文獻[9]設(shè)置。

2.3 小鼠行為學(xué)檢測

2.3.1 易激惹程度評分 參考文獻[10]，造模結(jié)束后，對小鼠易激惹程度進行評分。Ⅰ級：捉持頸部時尖叫、驚跳；Ⅱ級：捉持頸部時咬人；Ⅲ級：提尾時尖叫、驚跳甚至咬人或與同籠小鼠頻繁打斗；上述情況不明顯為0級。

2.3.2 麻痹震顫評分 參考文獻[11]，造模結(jié)束后，對小鼠麻痹震顫進行評分。0分：與正常小鼠相似，無任何癥狀；1分：出現(xiàn)豎毛、弓背、間斷性細小震顫，但活動自如；2分：出現(xiàn)吞咽頻繁，頻繁性震顫，后肢張開，顫尾，活動逐漸受限；3分：出現(xiàn)流涎，持續(xù)性震顫，四肢僵硬，活動受限；4分：因全身麻痹而死亡。

2.3.3 懸掛實驗評分 參考文獻[12]，造模結(jié)束后，將各組小鼠倒置懸掛在長為30 cm、高為25 cm的鐵絲上，將兩前爪置于鐵絲中點處，而后放開小鼠，如小鼠雙后爪抓住鐵絲則得0分，如小鼠后爪反復(fù)抓取鐵絲且可間斷抓握則得0.5分，如小鼠單只后爪抓握鐵絲則得1分，如小鼠雙后爪均不能抓握鐵絲則得2分，檢測時間為2 min。

2.3.4 游泳實驗評分 參考文獻[13]，造模結(jié)束后，將各組小鼠放置于40 cm×30 cm×20 cm規(guī)格的水箱中，水溫為（25±2）℃，水深為15 cm，記錄小鼠3 min內(nèi)的漂浮時間。評分標(biāo)準(zhǔn)為：漂浮0～30 s，記0分；漂浮31～90 s，記1分；漂浮91～150 s，記2分；漂浮151～180 s，記3分。

2.4 小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)觀察

藥物干預(yù)結(jié)束后，每組隨機取5只小鼠，處死后，冰上快速取小鼠腦黑質(zhì)，大小約1 mm3，將腦黑質(zhì)置于2.5%戊二醛溶液中4℃固定過夜，乙醇、丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙酮、環(huán)氧樹脂浸透，環(huán)氧樹脂包埋，制備半薄切片和超薄切片，進行雙重染色，于透射電子顯微鏡下觀察小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)變化。

2.5 小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元的檢測

采用SP免疫組化法進行檢測。取“2.4”項下腦黑質(zhì)適量，固定于4%多聚甲醛溶液中，4℃保存72 h，脫水浸蠟后進行石蠟包埋，制備冠狀切片，脫蠟、水化處理后，抗原修復(fù)，滴加TH抗體（稀釋比例為1∶100），孵育過夜；磷酸鹽緩沖液漂洗后滴加二抗孵育10 min，DAB工作液顯色后經(jīng)蘇木精復(fù)染，清水充分清洗反藍，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元的表達情況，采集圖片，使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算平均光密度（平均光密度值越高表示TH陽性神經(jīng)元表達越強）。

2.6 小鼠腦黑質(zhì)相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測

采用生物化學(xué)法進行檢測。取剩余5只小鼠，處死后，冰上快速取小鼠腦黑質(zhì)，與“2.4”項下腦黑質(zhì)合并，并滴加預(yù)冷的生理鹽水制備組織勻漿液，低溫離心后取上清液，依據(jù)相關(guān)試劑盒說明書測定T-AOC、MDA的含量及SOD活性。

2.7 小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1和Txnip mRNA表達的檢測

采用實時熒光定量PCR法進行檢測。取“2.6”項下腦黑質(zhì)適量，使用Trizol試劑提取腦黑質(zhì)總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模版2 μL，dNTP溶液1.6 μL，上、下游引物各 0.8 μL，BeyoTaq Buffer 2 μL，BeyoTaq DNA Polymerase 0.1 μL，加雙蒸水至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性20 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算Nrf2、Trxr1和Txnip mRNA的相對表達量。

2.8 小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1和Txnip蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.6”項下腦黑質(zhì)適量，提取各組小鼠腦黑質(zhì)總蛋白，用BCA法檢測蛋白含量，將蛋白變性后經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入Nrf2、Trxr1、Txnip、lamin B和GAPDH抗體（稀釋比例均為1∶1 000），4℃過夜；加入生物素標(biāo)記的IgG二抗（稀釋比例為1∶1 000），于室溫下孵育2 h，TBST洗膜后進行ECL化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使用Image J軟件對免疫印跡條帶進行密度掃描。以Nrf2與內(nèi)參蛋白lamin B，Trxr1、Txnip與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值的比值表示Nrf2、Trxr1和Txnip蛋白的表達水平。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，等級資料采用Ridit分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 牛膝-白芍藥對對肝陽上亢型PD小鼠易激惹程度的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠性情暴躁，易激惹程度Ⅱ、Ⅲ級小鼠只數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組易激惹程度Ⅰ級小鼠只數(shù)均增加，Ⅱ、Ⅲ級小鼠只數(shù)均減少，大部分組別均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對組易激惹程度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級小鼠只數(shù)與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組、牛膝組、白芍組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠行為學(xué)檢測結(jié)果

3.2 牛膝-白芍藥對對肝陽上亢型PD小鼠麻痹震顫水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠麻痹震顫情況嚴重，得分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠麻痹震顫情況均有不同程度改善，得分均顯著降低（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對組小鼠得分均顯著低于牛膝組、白芍組（P＜0.05），與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

3.3 牛膝-白芍藥對對肝陽上亢型PD小鼠懸掛實驗和游泳實驗評分的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠懸掛實驗和游泳實驗得分均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠懸掛實驗和游泳實驗得分均顯著降低（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對組小鼠得分均顯著低于牛膝組、白芍組（P＜0.05），與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

3.4 牛膝-白芍藥對對肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

正常對照組小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元細胞核清晰可見，游離核糖體豐富，線粒體結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常。模型組小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元細胞核固縮，核周隙增寬，線粒體腫脹，游離核糖體減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。與模型組比較，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元細胞核形態(tài)較規(guī)則，細胞器結(jié)構(gòu)較完好；牛膝組和白芍組小鼠腦黑質(zhì)核固縮減輕不明顯；牛膝-白芍藥對組小鼠腦黑質(zhì)核固縮減輕，細胞器結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。結(jié)果見圖1（圖中箭頭指向細胞核變化部位）。

圖1 各組小鼠腦黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)圖（×13 000）

3.5 牛膝-白芍藥對對肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達水平均顯著升高（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達水平均顯著高于牛膝組、白芍組（P＜0.05），與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達結(jié)果（±s，n＝5）

表3 各組小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達結(jié)果（±s，n＝5）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與牛膝-白芍藥對組比較，P＜0.05

平均光密度0.28±0.04bc 0.26±0.06bc 0.46±0.02b組別正常對照組模型組鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組平均光密度0.57±0.02 0.16±0.04a 0.49±0.06b組別牛膝組白芍組牛膝-白芍藥對組

3.6 牛膝-白芍藥對對肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦黑質(zhì)中T-AOC和SOD表達水平均顯著降低，MDA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組（除白芍組外）小鼠腦黑質(zhì)中T-AOC和SOD表達水平均顯著升高，MDA表達水平均顯著降低（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對組小鼠腦黑質(zhì)中T-AOC和SOD表達水平均顯著高于牛膝組、白芍組，MDA表達水平均顯著低于牛膝組、白芍組（P＜0.05），上述指標(biāo)與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果（±s，n＝10）

表4 各組小鼠腦黑質(zhì)氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與牛膝-白芍藥對組比較，P＜0.05

MDA/（mol/mg）7.12±1.53 17.28±5.24a 9.61±1.26b 13.44±3.21bc 15.47±5.10c 10.07±2.54b組別正常對照組模型組鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組牛膝組白芍組牛膝-白芍藥對組T-AOC/（mol/mg）1.75±0.24 0.52±0.10a 1.38±0.35b 0.81±0.33bc 0.60±0.17c 1.34±0.28b SOD/%100.00 35.24±13.26a 69.09±8.41b 50.21±10.63bc 41.24±7.15c 68.96±6.38b

3.7 牛膝-白芍藥對對肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1、Txnip mRNA和蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Txnip mRNA相對表達量和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平均顯著升高，Txnip mRNA相對表達量和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）；牛膝-白芍藥對組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平均顯著高于牛膝組、白芍組，Txnip mRNA相對表達量和蛋白表達水平均顯著低于牛膝組、白芍組（P＜0.05），上述指標(biāo)與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表5、圖2。

表5 各組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1、Txnip mRNA和蛋白表達結(jié)果（±s，n＝5）

表5 各組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1、Txnip mRNA和蛋白表達結(jié)果（±s，n＝5）

a：與正常對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與牛膝-白芍藥對組比較，P＜0.05

組別正常對照組模型組鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯組牛膝組白芍組牛膝-白芍藥對組mRNA相對表達量Nrf2 1.00±0.08 1.17±0.24 2.01±0.11b 1.35±0.41bc 1.32±0.26bc 1.89±0.24b Trxr1 1.00±0.13 1.12±0.03 1.86±0.23b 1.25±0.16bc 1.20±0.09bc 1.66±0.09b Txnip 1.00±0.15 2.28±0.35a 1.44±0.41b 1.81±0.20bc 1.91±0.10bc 1.50±0.21b蛋白表達水平/%Nrf2 100.00 110.14±16.82 277.31±26.25b 157.36±19.42bc 150.11±24.15bc 265.27±19.52b Trxr1 100.00 107.35±19.25 289.54±34.15b 146.58±19.21bc 139.61±11.19bc 276.13±10.45b Txnip 100.00 290.36±12.15a 144.21±22.46b 234.59±19.70bc 261.10±14.21bc 138.64±16.33b

圖2 各組小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1、Txnip蛋白表達電泳圖

4 討論

中醫(yī)學(xué)認為PD屬于“顫證”范疇，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》就有“諸風(fēng)掉眩、皆屬于肝”的描述[14]。肝陽上亢是PD常見證候，附子味辛干，大熱，久用耗傷精血，奪肝腎之陰而使肝腎陰虛，陰不潛陽而肝陽偏亢，因此灌服附子可復(fù)制肝陽上亢模型[15]。MPTP可引起靈長類和嚙齒類動物腦黑質(zhì)和紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元死亡，這與PD的病理改變類似[16]。本研究采用附子煎液聯(lián)合MPTP誘導(dǎo)復(fù)制肝陽上亢型PD小鼠模型，用于考察牛膝-白芍藥對PD的干預(yù)作用，充分體現(xiàn)了中醫(yī)辨病與辨證結(jié)合的特色。

臨床研究報道，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯防治肝陽上亢型PD效果明顯[17]，但是中藥復(fù)方復(fù)雜，導(dǎo)致中醫(yī)方劑內(nèi)涵實質(zhì)難以被揭示。藥對是方劑組成的最小單位，也是方劑配伍的精華與核心所在。牛膝-白芍是鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的核心藥對：牛膝補益肝腎、引火下行，在抗氧化及免疫調(diào)節(jié)方面有一定功效；白芍養(yǎng)血濡筋、緩急止痙，有較好的神經(jīng)保護及抗炎作用[18]，兩藥聯(lián)用起到與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯相似的抗PD作用和“鎮(zhèn)肝熄風(fēng)”作用。TH作為檢測多巴胺能神經(jīng)元的金標(biāo)準(zhǔn)，可以反映出神經(jīng)元的位置和數(shù)量，用來判斷MPTP誘導(dǎo)的PD模型的嚴重程度[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，牛膝-白芍藥對能夠顯著改善模型小鼠易激惹的程度，減輕麻痹震顫現(xiàn)象，增加小鼠懸掛和游泳的時間，增加小鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元表達水平，對細胞核的超微結(jié)構(gòu)變化所有改善，且牛膝-白芍藥對的效果強于牛膝、白芍單味藥材，與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的效果相近。

有關(guān)報道闡述，氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致PD等諸多神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素[20]。T-AOC、SOD和MDA是反映氧化應(yīng)激的常用檢測指標(biāo)，能夠表達抗氧化損傷的能力及氧化損傷的程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)中T-AOC和SOD的表達水平均顯著降低，而MDA表達水平顯著升高，說明模型小鼠腦氧化損傷程度較高；而各給藥組可抑制肝陽上亢型PD小鼠發(fā)生氧化應(yīng)激，且牛膝-白芍藥對的效果強于牛膝、白芍單味藥材，與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的效果相近。

Nrf2是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子，能夠激活內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答，是抗氧化還原的中樞調(diào)節(jié)者[22]。Trxr1具有調(diào)節(jié)氧化還原、激活轉(zhuǎn)錄因子和防治PD等多種生物活性，Nrf2可直接與Trxr1啟動子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合從而促進Trxr1表達[23]。Txnip是氧化應(yīng)激效應(yīng)途徑中的一個關(guān)鍵調(diào)控蛋白，過度表達時可使細胞更易發(fā)生氧化應(yīng)激甚至凋亡[24]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2和Trxr1表達水平與正常對照組比較均無顯著差異，Txnip表達升高，而牛膝-白芍藥對可上調(diào)肝陽上亢型PD小鼠腦黑質(zhì)中Nrf2、Trxr1的表達水平，下調(diào)負反饋因子Txnip的表達水平，這說明牛膝-白芍藥對可調(diào)控上述因子的表達，從而起到抗PD的作用。

綜上所述，牛膝-白芍藥對具有改善肝陽上亢型小鼠PD樣行為的作用，可能以Nrf2為靶點抑制肝陽上亢型PD小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平，對腦部神經(jīng)起到保護作用，且效果優(yōu)于牛膝、白芍單味藥材，能夠發(fā)揮與組方相當(dāng)?shù)难a腎柔肝、潛陽熄風(fēng)的功效。