錢怡潔，魏 偉，朱廣飛，皮文霞，陸兔林，毛春芹（南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210023）

山茱萸為山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，具有固精縮尿、補腎益精、收斂止汗之功效，為收澀固脫之要藥，常用于治療眩暈耳鳴、腰膝酸痛、崩漏帶下、大汗虛脫等癥[1]。2020年版《中國藥典》（一部）收載了凈山萸肉（山萸肉）和酒萸肉2種飲片[1]，酒萸肉較凈山萸肉具有更強的滋補肝腎作用[2]。飲片是中藥材經(jīng)炮制后用于臨床的藥物，飲片的質(zhì)量可直接影響臨床療效，目前山茱萸飲片的質(zhì)量研究主要集中在內(nèi)在成分的定量分析方面[3]，而外觀性狀作為評價中藥質(zhì)量的常用手段，仍停留在主觀描述層面，主要通過眼觀、鼻聞、口嘗等方式判斷質(zhì)量優(yōu)劣[4]，這難以控制質(zhì)量且缺乏客觀性。

氣味是評價中藥飲片質(zhì)量的重要指標之一[5]。2020年版《中國藥典》（一部）山茱萸炮制項下規(guī)定，酒萸肉通過“酒蒸法”或“酒燉法”所得，且應“微有酒香氣”[1]，目前山茱萸的氣味研究主要采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[6]，但該方法在樣品前處理和操作方面較為繁瑣，無法模擬人鼻子對氣味的識別，具有一定的局限性，且不能客觀體現(xiàn)酒萸肉的酒香氣。

超快速氣相電子鼻具有靈敏度高、分析時間短、高通量、樣本處理簡單等優(yōu)點[7]，其自帶的計量學模型可用于新樣本和未知樣本的識別與分組，可快速識別未知樣本，現(xiàn)已在中藥硫磺熏蒸質(zhì)量鑒別[8]、中藥產(chǎn)地鑒別[9]、飲片炮制[10]等領(lǐng)域廣泛應用?；诖?，本研究使用超快速氣相電子鼻建立了凈山萸肉及酒萸肉的氣味色譜圖，分析山茱萸炮制過程中的氣味動態(tài)變化及氣味差異標志物，旨在從氣味方面為山茱萸炮制動態(tài)監(jiān)控提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Heracles Neo型超快速氣相電子鼻、PAL RSI型自動進樣器（法國Alpha Mos公司），F(xiàn)A1104N型電子天平（上海菁海儀器有限公司），DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

正構(gòu)烷烴混合標準品（批號A10142930，每100 g混合物中含正構(gòu)烷烴0.02～52.27 g）購自美國Restek公司；黃酒（酒精度≥15.0%）購自浙江古越龍山紹興酒股份有限公司；山茱萸藥材（批號2005042，產(chǎn)地河南）購自揚子江藥業(yè)集團，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院陸兔林教授鑒定為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸C.officinalisSieb.et Zucc.的干燥成熟果肉。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品的制備

按2020年版《中國藥典》（四部）通則“酒蒸法”炮制[11]。取山茱萸藥材，除去果核、果梗等雜質(zhì)，得凈山萸肉，平行制備3批（編號S）。取凈山萸肉100 g，用黃酒悶潤，密閉，分別于蒸制1、2、4、6、8、10、12、18、24 h時取出，稍晾，干燥，每個時間點平行炮制3批樣品，即得27批酒萸肉供試品（編號分別為Z1、Z2、Z4、Z6、Z8、Z10、Z12、Z18、Z24），取樣品粉碎，過三號篩。每100 kg凈山萸肉用黃酒20 kg。

2.2 單因素考察

2.2.1 進樣量 取酒萸肉（編號Z8）粉末1 g，精密稱定，設(shè)置孵育溫度60℃、孵育時間20 min、捕集阱捕集溫度40 ℃，考察不同進樣量（1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μL）對氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結(jié)果顯示，隨著進樣量的增加，色譜峰的峰面積不斷增大；當進樣量為4 000 μL時，色譜峰數(shù)目不再增加，峰面積趨于飽和，峰形良好，故選擇進樣量為4 000 μL。

2.2.2 孵育溫度 取酒萸肉（編號Z8）粉末1 g，精密稱定，設(shè)置進樣量4 000 μL、孵育時間20 min、捕集阱捕集溫度40℃，考察不同孵育溫度（40、50、60℃）對氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結(jié)果顯示，當孵育溫度為60℃時，色譜峰數(shù)目最多，峰面積最大，峰形良好，故選擇孵育溫度為60℃。

2.2.3 孵育時間 取酒萸肉（編號Z8）粉末1 g，精密稱定，設(shè)置進樣量4 000 μL、孵育溫度60℃、捕集阱捕集溫度40 ℃，考察不同孵育時間（10、20、30、40 min）對氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結(jié)果顯示，隨著孵育時間的延長，色譜峰峰面積增大；當孵育時間為20 min時，色譜峰峰面積趨于飽和，峰形良好，故選擇孵育時間為20 min。

2.2.4 捕集阱捕集溫度 取酒萸肉（編號Z8）粉末1 g，精密稱定，設(shè)置進樣量4 000 μL、孵育溫度60℃、孵育時間20 min，考察不同捕集阱捕集溫度（30、40、50℃）對氣味色譜峰峰面積和峰形的影響。結(jié)果顯示，隨著捕集阱捕集溫度的增加，色譜峰峰面積增大；當捕集阱捕集溫度為40℃時，色譜峰數(shù)目無明顯變化，峰面積趨于飽和，峰形良好，故選擇捕集阱捕集溫度為40℃。

2.3 檢測條件

本研究所用的色譜柱為低極性MXT-5（交聯(lián)5%聯(lián)苯/95%二甲基聚硅氧烷）、中極性MXT-1701（交聯(lián)14%氰丙基苯/86%二甲基聚硅氧烷）金屬毛細管柱，規(guī)格均為10 m×0.18 mm×0.4μm；樣品瓶為20 mL；樣品量為1 g；進樣量為4 000 μL；孵育溫度為60℃；孵育時間為20 min；進樣速度為125 μL/s；進樣持續(xù)時間為37 s；進樣口溫度為200℃；捕集阱捕集溫度為40℃；捕集阱分流速度為10 mL/min；捕集持續(xù)時間為42 s；捕集阱最終捕集溫度為240℃；初始溫度為50℃，程序升溫（以1℃/s升至80℃，以3℃/s升至250℃，保持21 s）；采集時間為110 s；火焰離子化檢測器增益為12。

2.4 方法學考察

取酒萸肉（編號Z8）粉末約1 g，共6份，精密稱定，按“2.3”項下檢測條件進樣分析，記錄峰面積，考察方法精密度和重復性；取酒萸肉（編號Z8）粉末約1 g，共7份，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h時按“2.3”項下檢測條件進樣分析，記錄峰面積，考察樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，RSD均小于5%，表明方法精密度、重復性均較好，樣品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 山茱萸炮制過程的氣味定性分析

取凈山萸肉及酒萸肉，按“2.3”項下檢測條件連續(xù)進樣3次，將色譜峰保留時間（tR）轉(zhuǎn)化成Kovates保留指數(shù)（RI），通過與AroChemBase數(shù)據(jù)庫比對，得到氣味化合物定性分析結(jié)果（表1）；采用Origin軟件繪制氣味色譜圖（圖1、圖2）。由于MXT-5色譜柱的色譜峰分離度較好，故以MXT-5色譜柱為代表呈現(xiàn)具體的峰面積均值（表2）。結(jié)果顯示，凈山萸肉共識別出12個共有氣味色譜峰（峰1～5、7～10、15、18、21）；共有氣味色譜峰峰面積占所有峰面積總和的比值從大到小依次為乙醇、糠醛、異丙醇、2-甲基丙醛、異戊醇、2-己醇、己醛、十二醛、（Z）-2-辛烯醛、5-甲基-5（H）-環(huán)戊吡嗪、乙酸乙酯（因空白瓶中也含有氯乙烷，故此峰不作為氣味色譜峰）。有研究認為，乙醇氣味可能來自果實存放過程中無氧呼吸釋放的乙醇[12]。異戊醇[13]、糠醛[14]、己醛[15]、十二醛[15]、2-辛烯醛[15]的檢出已有文獻報道。酒萸肉共識別出21個共有氣味色譜峰（峰1～21），其中峰6、11～14、16～17、19～20為炮制后新增氣味色譜峰。

表1 氣味化合物定性分析結(jié)果

圖1 凈山萸肉和酒萸肉的氣味色譜圖

圖2 凈山萸肉和酒萸肉在MXT-5色譜柱上的氣味色譜圖

表2 凈山萸肉和酒萸肉在MXT-5色譜柱上的氣味色譜峰峰面積均值

2.6 山茱萸炮制過程的氣味動態(tài)變化分析

2.6.1 主要氣味成分 山茱萸炮制過程中，峰面積較高的氣味成分分別為乙醇、異丙醇、2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-甲基丁醛、異戊醇、2-己醇、糠醛，其峰面積總和在色譜圖中占比超過80%，表明這8個氣味成分可以代表山茱萸炮制過程的氣味變化。上述8個氣味成分中，乙醇的色譜峰峰面積占比最高（除炮制24 h的樣品外），均大于50%；其次為糠醛（僅在炮制24 h的樣品中超過乙醇，達33.66%）；且這8個氣味成分炮制后峰面積均增加，如乙醇、異戊醇、2-己醇及異丙醇的峰面積在炮制2 h時達到最大值，后呈下降趨勢，但在炮制24 h時仍高于凈山萸肉；乙酸乙酯、2-甲基丁醛、糠醛的峰面積隨炮制時間增加而增加；2-甲基丙醛的峰面積變化無明顯規(guī)律。

2.6.2 其他氣味成分 除上述8個成分外的其他氣味色譜峰峰面積在色譜圖中的占比較低，均不高于3.00%。己醛既是山茱萸固有氣味成分也是黃酒的風味物質(zhì)[16]，在炮制過程中其峰面積隨炮制時間增加而不斷增加；十二醛、（Z）-2-辛烯醛的峰面積隨炮制時間增加呈下降趨勢；3-甲硫基丙醛、苯甲醛、3-巰基-3-甲基-1-丁醇、5-甲基呋喃、2-壬酮、3-甲硫基丙酸乙酯、對甲基苯乙酮、甲基糠基二硫的峰面積均隨炮制時間增加而不斷增加，在炮制18～24 h時趨于穩(wěn)定；5-甲基-5（H）-環(huán)戊吡嗪的峰面積在炮制0～2 h時增加，之后趨于穩(wěn)定。

2.7 化學模式識別分析

2.7.1 主成分分析 以凈山萸肉及酒萸肉的21個氣味色譜峰峰面積為變量，采用Alpha Soft V14.2軟件進行主成分分析。結(jié)果顯示，主成分1的貢獻率為99.046 0%，主成分2的貢獻率為0.928 2%，累計貢獻率為99.974 2%，表明前2個主成分能反映凈山萸肉及酒萸肉的氣味信息。結(jié)果見圖3。

圖3 凈山萸肉和酒萸肉的主成分分析圖

2.7.2 判別因子分析 以凈山萸肉及酒萸肉的21個氣味色譜峰峰面積為變量，采用Alpha Soft V14.2軟件進行判別因子分析。結(jié)果顯示，因子1和因子2的累計貢獻率為83.003%，表明不同炮制時間的酒萸肉能得到有效區(qū)分，與主成分分析結(jié)果一致。結(jié)果見圖4。

圖4 凈山萸肉和酒萸肉的判別因子分析圖

2.7.3 偏最小二乘法-判別分析 以凈山萸肉及酒萸肉的21個氣味色譜峰峰面積為變量，采用SIMCA14.1軟件進行偏最小二乘法-判別分析。結(jié)果顯示，模型解釋率（R2Y）為0.753，模型預測率（Q2）為0.686，均大于0.5，表明模型具有良好的解釋率和可靠性。變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值大于1被認為是對分類貢獻較大的變量[17]。結(jié)果顯示，乙醇、糠醛、2-甲基丙醛、2-己醇、乙酸乙酯、異丙醇、2-甲基丁醛、異戊醇、甲基糠基二硫的VIP值均大于1，提示這9個氣味成分是影響山茱萸飲片氣味的差異標志物。將21個氣味色譜峰峰面積導入SPSS 24軟件進行Kruskal-Wallis檢驗，結(jié)果顯示，各色譜峰峰面積均有顯著性（P＜0.01）。結(jié)合“2.6.1”項下結(jié)果，上述9個氣味成分中僅甲基糠基二硫的峰面積占比較低，因此可將乙醇、異丙醇、2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-甲基丁醛、異戊醇、2-己醇、糠醛作為山茱萸炮制過程客觀量化的監(jiān)測指標。結(jié)果見圖5。

圖5 21個氣味色譜峰的VIP值

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，乙醇是黃酒香氣的主要成分[18]，而異戊醇、異丙醇為乙醇發(fā)酵的代謝產(chǎn)物[19]；乙酸乙酯、2-己醇普遍存在于發(fā)酵酒中，前者具有水果、黃油、焦糖香氣，后者具有花椰菜、葡萄酒香氣[20-21]；糠醛、2-甲基丁醛、2-甲基丙醛是美拉德反應中Strecker降解產(chǎn)生的風味化合物[22]，廣泛存在于釀造酒、烘焙食品中，前二者具有堅果香氣，2-甲基丙醛具有烘焙馬鈴薯、水果香氣[23-25]?？啡?-甲基丁醛是炒制過程產(chǎn)生香氣的物質(zhì)基礎(chǔ)[26]。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，得出乙醇、乙酸乙酯、異戊醇、2-己醇、糠醛為黃酒的氣味特征峰；糠醛為炮制加熱與輔料黃酒共有的氣味特征峰；異丙醇、2-甲基丙醛、2-甲基丁醛為山茱萸的氣味峰，其中2-甲基丁醛為山茱萸炮制加熱產(chǎn)生的特征峰。

本研究結(jié)果顯示，山茱萸炮制后，黃酒氣味特征峰乙醇、異戊醇、2-己醇的峰面積隨著炮制時間增加，呈先增加后降低趨勢，在炮制2 h時達到最大值后呈下降趨勢；炮制24 h時，這3個氣味特征峰的峰面積仍略高于凈山萸肉，這提示山茱萸的炮制時間不宜過長，時間過長可使酒萸肉的酒香氣消失；此外，2-甲基丁醛和糠醛也隨炮制時間增加，峰面積總體不斷增加，其中糠醛為美拉德反應產(chǎn)生的風味物質(zhì)，該成分具有內(nèi)臟、神經(jīng)等毒性[27]，這也提示了山茱萸的炮制時間不宜過長。

主成分分析和判別因子分析結(jié)果均可以有效區(qū)分不同炮制時間的酒萸肉。結(jié)果顯示，隨著炮制時間增加，酒萸肉的氣味發(fā)生了明顯變化，這為辨別不同炮制時間酒萸肉提供了科學依據(jù)。偏最小二乘法-判別分析結(jié)果顯示，乙醇等9個氣味成分的VIP值均大于1，是影響酒萸肉氣味的差異標志物，結(jié)合氣味動態(tài)變化分析結(jié)果，提示乙醇、異丙醇、2-甲基丙醛、乙酸乙酯、2-甲基丁醛、異戊醇、2-己醇、糠醛可作為山茱萸炮制過程的監(jiān)測指標。

綜上所述，本研究建立了山茱萸炮制過程中氣味成分的動態(tài)變化監(jiān)測方法，乙醇等8個氣味成分可作為山茱萸炮制過程的監(jiān)測指標。