吳怡蓓

（銅仁學(xué)院 貴州銅仁 554300）

桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalisHendel）屬雙翅目實(shí)蠅科果實(shí)蠅屬[1]，又名針?lè)涞?，原產(chǎn)于日本九州，在我國(guó)最先發(fā)現(xiàn)于云貴高原，是危害性極高的國(guó)家二類(lèi)檢疫性害蟲(chóng)。近年來(lái)，桔小實(shí)蠅在我國(guó)西南區(qū)域大面積爆發(fā)，引發(fā)慘重的經(jīng)濟(jì)虧損，成為相關(guān)領(lǐng)域研究的“新寵”。對(duì)桔小實(shí)蠅的防控目前仍然主要采用化學(xué)藥物防控手段，然而由于長(zhǎng)期不規(guī)范地大范圍使用殺蟲(chóng)劑，使其產(chǎn)生了強(qiáng)抗藥性，只得加大用藥量。為了緩解此類(lèi)惡性循環(huán)，需要加快綠色試劑的研制。目前，對(duì)桔小實(shí)蠅的研究已經(jīng)從單學(xué)科獨(dú)立研究深入到多學(xué)科交叉并輔以多種技術(shù)，防控切入點(diǎn)從外部環(huán)境轉(zhuǎn)移至害蟲(chóng)的內(nèi)環(huán)境，其中生長(zhǎng)發(fā)育所需的重要激素成為研究首選[2]。

蛻皮激素（molting hormone, MH），在昆蟲(chóng)體內(nèi)受腦神經(jīng)分泌到血淋巴的PTTH的調(diào)節(jié)與控制，存儲(chǔ)于中腸、馬氏管和脂肪體等組織中，能通過(guò)一定途徑誘導(dǎo)細(xì)胞程序化死亡和自噬而調(diào)節(jié)蛻皮、決定蟲(chóng)體的大小和形態(tài)變化，并使組織細(xì)胞更新、產(chǎn)生新功能，當(dāng)保幼激素濃度為零時(shí)，可加快幼蟲(chóng)的內(nèi)部器官的功能分化，發(fā)生變態(tài)，成蟲(chóng)蛻皮，被廣泛應(yīng)用于化妝品、藥物保健、病蟲(chóng)害防治、養(yǎng)殖業(yè)等[3-5]。蛻皮激素能夠誘導(dǎo)幼蟲(chóng)周期性蛻皮和化蛹，除了促進(jìn)成蟲(chóng)翅的發(fā)育和分化外，對(duì)成蟲(chóng)繁殖、滯育及胚后發(fā)育等也起著調(diào)節(jié)作用，并能刺激其腦細(xì)胞的增生和卵黃蛋白的合成[6]。保幼激素（juvenile hormone, JH），具有維持幼蟲(chóng)體征，保持前胸腺，影響昆蟲(chóng)生殖的作用。JH作為幼蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育為成蟲(chóng)的“開(kāi)關(guān)”，不同變態(tài)發(fā)育類(lèi)型蟲(chóng)體轉(zhuǎn)變時(shí)激素濃度不同，在腦激素的主導(dǎo)下，再聯(lián)合蛻皮激素一同發(fā)揮作用，共同調(diào)控昆蟲(chóng)生殖代謝、催化反應(yīng)，甚至聯(lián)合昆蟲(chóng)的類(lèi)胰島素及其通路對(duì)壽命進(jìn)行調(diào)控[7]。胰島素（insulin, INS）對(duì)機(jī)體的正常 生長(zhǎng)繁殖、新陳代謝、動(dòng)作行為等過(guò)程具有不可替代的調(diào)節(jié)作用[8]，其信號(hào)位點(diǎn)處于保幼激素前，需要與其他激素聯(lián)合發(fā)生連鎖反應(yīng)以達(dá)到調(diào)節(jié)目的[9]。相關(guān)研究表明，胰島素與蛻皮激素和保幼激素及其相關(guān)受體間存在相互作用關(guān)系，彼此間相互影響，聯(lián)合調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育[10]。放眼未來(lái)，昆蟲(chóng)的內(nèi)源激素能在病蟲(chóng)害防控的實(shí)際操作中展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢(shì)和開(kāi)發(fā)潛能。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究所用桔小實(shí)蠅均使用合作單位西南大學(xué)昆蟲(chóng)生態(tài)分子實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)種群。

1.2 處理方法

通過(guò)鮮榨的橙汁引導(dǎo)適齡雌蟲(chóng)產(chǎn)卵，收集卵置于流水下清洗干凈，隨機(jī)選取足量完整的卵在保鮮膜上孵化0.25 d。將孵化時(shí)間內(nèi)孵出的幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至人工飼養(yǎng)環(huán)境。在臺(tái)式顯微鏡下，手持桔小實(shí)蠅5日齡幼蟲(chóng)，將配制好的三種激素（INS、JH以及MH）母液500 ng分別于倒數(shù)第3腹節(jié)背面節(jié)間處注射進(jìn)入幼蟲(chóng)體內(nèi)，以加入染料的緩沖液（ddH2O）作為對(duì)照。注射完后將幼蟲(chóng)重新放入含幼蟲(chóng)飼料的培養(yǎng)皿中，放置于人工氣候箱中飼養(yǎng)，溫度為（27±0.5）℃，相對(duì)濕度為（70±5）%，無(wú)光照。激素注射后第1 h、4 h、8 h、12 h觀察，并隨機(jī)挑取6頭幼蟲(chóng)，快速投入液氮中，保存于-80 ℃，每組樣品3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理使用Microsoft office Excel軟件完成，數(shù)據(jù)由MxPro 4.01導(dǎo)出，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行分析[11]。數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA，LSD）或獨(dú)立樣本t測(cè)驗(yàn)，對(duì)激素表達(dá)水平進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)三種重要生長(zhǎng)激素滴度測(cè)定

2.1.1 桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)INS滴度

將100 μg/mL的INS母液分別稀釋1.25倍、2.5倍、5倍、10倍、20倍后，通過(guò)高效液相色譜儀對(duì)六組標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行進(jìn)樣分析得出多峰色譜圖，不同實(shí)驗(yàn)濃度的第一個(gè)小峰到最后一個(gè)小峰均出現(xiàn)在17 min～18 min間，主峰靠近18 min，說(shuō)明INS溶液的出峰時(shí)間與主峰出現(xiàn)時(shí)間重合，均在18 min左右。使用Microsoft office Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1（a）所示，推算出峰面積與濃度的關(guān)系為y=7.9623x+9.1758，其R2值為0.9982。

收集不同蟲(chóng)齡桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)，利用HPLC技術(shù)測(cè)定幼蟲(chóng)體內(nèi)INS的滴度，結(jié)果顯示，INS在桔小實(shí)蠅的整個(gè)幼蟲(chóng)時(shí)期均有表達(dá)，且滴度變化相對(duì)平穩(wěn)，只有在L5階段有顯著的升高，平均滴度為18.489 38 ng/g，其余時(shí)期其滴度均無(wú)顯著性差異。

2.1.2 桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)JH滴度

將100 μg/mL的JH-Ⅲ母液分別稀釋1.25倍、2.5倍、5倍、10倍、20倍后，通過(guò)高效液相色譜儀對(duì)六組標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行進(jìn)樣分析得出多峰色譜圖，不同實(shí)驗(yàn)濃度的第一個(gè)小峰到最后一個(gè)小峰均出現(xiàn)在11 min～13 min間，主峰靠近11 min，說(shuō)明JH-Ⅲ溶液的出峰時(shí)間與主峰出現(xiàn)時(shí)間重合，均在11 min左右。使用Microsoft office Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1（b）所示，推算出峰面積與濃度的關(guān)系為y=8.1949x+9.6512，其R2值為0.9984。

收集不同蟲(chóng)齡桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)，利用HPLC技術(shù)測(cè)定幼蟲(chóng)體內(nèi)JH的滴度，結(jié)果顯示，JH在桔小實(shí)蠅的整個(gè)幼蟲(chóng)時(shí)期均有表達(dá)，且滴度變化相對(duì)較大。其中，在L3階段JH滴度水平達(dá)到最高值27.953 94 ng/g，顯著高于其他時(shí)期，隨后逐漸降低。

2.1.3 桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)MH滴度

將100 μg/mL的MH母液分別稀釋1.25倍、2.5倍、5倍、10倍、20倍后，通過(guò)高效液相色譜儀對(duì)六組標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行進(jìn)樣分析得出多峰色譜圖，不同實(shí)驗(yàn)濃度的第一個(gè)小峰到最后一個(gè)小峰均出現(xiàn)在20 min～21 min間，主峰靠近21 min，說(shuō)明MH溶液的出峰時(shí)間與主峰出現(xiàn)時(shí)間重合，均在21 min左右。使用Microsoft office Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1（c）所示，推算出峰面積與濃度的關(guān)系為y=9.9623x+9.5872，其R2值為0.9937。

圖1 三種激素滴度標(biāo)準(zhǔn)曲線

收集不同蟲(chóng)齡桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)，利用HPLC技術(shù)測(cè)定幼蟲(chóng)體內(nèi)MH的滴度，結(jié)果顯示，MH在桔小實(shí)蠅的整個(gè)幼蟲(chóng)時(shí)期均有表達(dá)，滴度變化相對(duì)平穩(wěn)，只有在L3與L5階段有顯著性差異，其余時(shí)期其滴度均無(wú)顯著性差異。

2.1.4 桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)三種重要生長(zhǎng)激素滴度水平相互關(guān)系

分析上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制出桔小實(shí)蠅體內(nèi)三種重要生長(zhǎng)激素滴度水平的相互關(guān)系圖如圖2。數(shù)據(jù)結(jié)果表明，INS、JH、MH三種激素在桔小實(shí)蠅的整個(gè)幼蟲(chóng)時(shí)期均有表達(dá)，其中INS與MH的滴度變化相對(duì)平穩(wěn)，只有在L3與L5階段有顯著性差異，其余時(shí)期其滴度均無(wú)顯著性差異；JH的滴度變化相對(duì)較大，在L3階段滴度水平顯著高于其他時(shí)期，其后逐漸降低。在桔小實(shí)蠅L1階段，JH的滴度水平為18.980 59 ng/g，顯著高于MH的13.767 76 ng/g，兩者與同時(shí)期桔小實(shí)蠅體內(nèi)INS滴度水平?jīng)]有顯著性差異。L3階段，桔小實(shí)蠅體內(nèi)INS與MH滴度水平均為12.733 18 ng/g，而同時(shí)期JH滴度水平為27.953 94 ng/g，顯著高于INS和MH滴度水平。L5及L7時(shí)期，三種激素均保持較高量表達(dá)，滴度水平之間不存在顯著性差異。

圖2 不同蟲(chóng)齡桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)三種生長(zhǎng)激素滴度

由此可以推出，INS、JH、MH三種激素在桔小實(shí)蠅從卵孵化后到化蛹前的生長(zhǎng)發(fā)育階段均發(fā)揮重要作用，且相互間存在動(dòng)態(tài)關(guān)系。

2.2 桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)三種重要生長(zhǎng)激素之間的相互影響

根據(jù)上述結(jié)果，選擇利用三種生長(zhǎng)激素表達(dá)量相對(duì)較高的L5時(shí)期的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)開(kāi)展三種生長(zhǎng)激素間的相互影響研究。

對(duì)桔小實(shí)蠅5日齡幼蟲(chóng)注射500 ng INS母液，利用HPLC技術(shù)檢測(cè)12 h后幼蟲(chóng)體內(nèi)JH、MH兩種激素的滴度水平。結(jié)果如圖3（a）所示，注射INS母液后，JH、MH兩種激素的滴度水平均顯著升高，說(shuō)明胰島素能促進(jìn)蛻皮激素和保幼激素的分泌，調(diào)控桔小實(shí)蠅生長(zhǎng)發(fā)育。

對(duì)桔小實(shí)蠅5日齡幼蟲(chóng)注射500 ng JH母液，利用HPLC技術(shù)檢測(cè)12 h后幼蟲(chóng)體內(nèi)INS、MH兩種激素的滴度水平。結(jié)果如圖3（b）所示，注射JH母液后，INS滴度水平顯著升高，而MH滴度水平顯著下降，說(shuō)明保幼激素能促進(jìn)胰島素的分泌同時(shí)抑制蛻皮激素的分泌，從而影響桔小實(shí)蠅的生長(zhǎng)發(fā)育。

對(duì)桔小實(shí)蠅5日齡幼蟲(chóng)注射500 ng MH母液，利用HPLC技術(shù)檢測(cè)12 h后幼蟲(chóng)體內(nèi)INS、JH兩種激素的滴度水平。結(jié)果如圖3（c）所示，注射MH母液后，INS滴度水平下降但不顯著，而JH滴度水平顯著下降，說(shuō)明蛻皮激素能抑制保幼激素的分泌，從而影響桔小實(shí)蠅的生長(zhǎng)發(fā)育。

圖3 一種激素處理后其他激素滴度水平變化

3 討論

變態(tài)類(lèi)昆蟲(chóng)成蟲(chóng)體型大小決定于化蛹前的營(yíng)養(yǎng)和激素水平，并且在幼蟲(chóng)期和若蟲(chóng)期其生長(zhǎng)速度很快。根據(jù)數(shù)據(jù)推斷出桔小實(shí)蠅蟲(chóng)卵孵化為幼蟲(chóng)后的前3 d里，幼蟲(chóng)處于最虛弱狀態(tài)，會(huì)出現(xiàn)一次蛻皮高峰期，迫切需要生理生化過(guò)程為其生長(zhǎng)發(fā)育提供“建材”以提升自己的生存機(jī)會(huì)。此時(shí)JH占據(jù)主導(dǎo)地位，聯(lián)合INS促進(jìn)幼蟲(chóng)的生殖代謝，促進(jìn)卵巢成熟，同時(shí)將脂肪體中的卵黃轉(zhuǎn)化為蛋白，成為營(yíng)養(yǎng)素的固著載體，提高免疫力的同時(shí)進(jìn)一步加強(qiáng)生理調(diào)節(jié)，是幼蟲(chóng)變態(tài)發(fā)育為成蟲(chóng)質(zhì)變所需的物質(zhì)積累。此時(shí)，較低濃度的MH促進(jìn)了組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，INS的液相色譜圖上出現(xiàn)小峰時(shí)，意味著表皮細(xì)胞開(kāi)始啟動(dòng)基因編碼程序使之從幼蟲(chóng)向蛹轉(zhuǎn)化。

依據(jù)上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)第1 d～3 d是其幼蟲(chóng)生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)累積的關(guān)鍵時(shí)期。因此，在該階段需要大量JH的作用來(lái)維持幼蟲(chóng)身體形態(tài)的穩(wěn)定性，所以JH含量顯著高于其他生長(zhǎng)激素。蟲(chóng)卵孵化后的5 d～8 d，三種激素滴度水平基本持平，有了一定的JH基礎(chǔ)后，昆蟲(chóng)的體積增大，對(duì)能量的需求也同步開(kāi)始增大，導(dǎo)致其對(duì)INS和MH的需求增大，隨著新陳代謝的加快，更新自身的細(xì)胞、組織，從而維持自身的生命活力。

在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，由于不同發(fā)育階段需要完成的生長(zhǎng)任務(wù)不同，體內(nèi)激素水平也會(huì)不一致。桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)胰島素、蛻皮激素、保幼激素在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均扮演者重要角色，三者之間能夠相互促進(jìn)、相互抑制，通過(guò)互相影響來(lái)維持桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)期生長(zhǎng)發(fā)育的穩(wěn)定性，滿足其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的不同需求，從而保證其正常生長(zhǎng)。昆蟲(chóng)的激素會(huì)借助體液、淋巴等調(diào)控其生活[2]，激素作用的研究因而不可規(guī)避。本研究采用HPLC技術(shù)對(duì)不同蟲(chóng)齡的桔小實(shí)蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)的INS、JH、MH的滴度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，三種激素在整個(gè)幼蟲(chóng)期均發(fā)揮了作用，彼此間相互影響。INS和MH呈漸進(jìn)式變化，而JH在L3階段發(fā)生跳躍式變化，含量顯著升高，與錢(qián)明惠等（2006）對(duì)雙斑恩蚜小蜂體內(nèi)激素變化探究結(jié)果[8]的趨勢(shì)一致，說(shuō)明能量轉(zhuǎn)換、組織細(xì)胞的更新?lián)Q代、蟲(chóng)體的營(yíng)養(yǎng)積累需要INS、MH的持續(xù)作用；在L3階段幼蟲(chóng)的形態(tài)發(fā)育和翅型的分化進(jìn)程大大加快，與張瓊秀等（2008）使用三種外源激素類(lèi)似物對(duì)不同階段白背飛虱翅型處理的最佳階段[12]結(jié)果相同。由MH與JH的含量變化可知，低濃度的MH可以促進(jìn)JH的合成，高濃度的MH會(huì)抑制JH的合成，JH與MH一同維護(hù)前胸腺正常運(yùn)行并承受神經(jīng)內(nèi)部的分泌系統(tǒng)釋放的應(yīng)激壓力[13]，咽側(cè)體受蛻皮激素刺激后會(huì)分泌出保幼激素在煙草天蛾中已經(jīng)被證實(shí)。

4 展望

本研究最終得出INS、JH和MH在桔小實(shí)蠅生長(zhǎng)發(fā)育中扮演著重要角色，發(fā)揮著不同作用。此前的研究也證實(shí)，蛻皮激素和保幼激素能通過(guò)各自的信號(hào)通路作用于靶細(xì)胞推動(dòng)相應(yīng)蛋白的合成，其研究成果已被廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)的增產(chǎn)增收上，而對(duì)于其調(diào)控卻還是存在著難以攻克的技術(shù)壁壘[14]。探索昆蟲(chóng)激素不僅為昆蟲(chóng)和激素的理論體系添磚加瓦，而且在農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治的實(shí)際應(yīng)用方面顯示出巨大的優(yōu)越性和潛力，能夠促進(jìn)新型生物農(nóng)藥與制劑的進(jìn)一步研發(fā)，并為持續(xù)防控害蟲(chóng)提供新的思路和方法。

5 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)INS與MH以及JH與MH間均存在協(xié)同作用，但目前對(duì)桔小實(shí)蠅的重要內(nèi)源激素，如胰島素、保幼激素類(lèi)似物、蛻皮激素等的系統(tǒng)研究尚少，內(nèi)在機(jī)制如JH和MH參與其形態(tài)發(fā)育時(shí)調(diào)控昆蟲(chóng)翅型分化等的機(jī)制還未被揭露，有待深入研究以切斷蟲(chóng)害發(fā)生地的延伸。