王宇飛 趙禹賀 李珊珊 劉 帥 徐曉龍

（1.德州學(xué)院 山東德州 253023；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 北京 100193）

當(dāng)前煤炭、石油、天然氣等不可再生資源被過(guò)度消耗，世界面臨著能源短缺問(wèn)題，石油、天然氣等資源消耗過(guò)程中產(chǎn)生的一氧化碳、二氧化碳等氣體，又造成了環(huán)境污染和溫室效應(yīng)等問(wèn)題。人類社會(huì)要走向可持續(xù)發(fā)展，必須尋求可再生的清潔能源。開發(fā)能源作物就是解決能源問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題的一個(gè)有效途徑[1]。第一代能源作物包括玉米、高粱、甘蔗、大豆、油菜等糧食作物或經(jīng)濟(jì)作物，但這些作物大多是一年生，需年年耕地播種，大量灌溉和施肥，投入能量相對(duì)較大。另外這些經(jīng)濟(jì)作物往往與糧食作物爭(zhēng)奪耕地，帶來(lái)了一系列負(fù)面影響[2]?；诖耍悦⒉?、柳枝稷、楊樹、柳樹等為代表的第二代能源作物應(yīng)運(yùn)而生，其特點(diǎn)是生物量高、管理成本低、適應(yīng)惡劣的氣候條件和貧瘠的土壤條件[3-4]。其中，芒屬（MiscanthusAndersson s. l.）植物具有生物量高、耐受力強(qiáng)、多年生等優(yōu)點(diǎn)，可用于與煤混合燃燒發(fā)電、發(fā)酵制造乙醇和環(huán)境修復(fù)等，在生物能源領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[5-6]。荻（Miscanthus sacchariflorus）是芒屬重要的能源物種，它主要分布在中國(guó)北方和中部地區(qū)，以及日本、韓國(guó)、朝鮮和俄羅斯，生長(zhǎng)于山坡、路邊、平原崗地和河岸濕地。荻作為一種C4植物，具有生物量高、抗寒、抗旱等優(yōu)良特性。荻還是現(xiàn)在廣泛推廣的三倍體雜交種M.×giganteus的親本，因此具有很重要的應(yīng)用價(jià)值[7]。

遺傳多樣性反映了個(gè)體之間的遺傳差異，正確評(píng)價(jià)現(xiàn)有栽培植物及其野生近緣物種的遺傳多樣性，是現(xiàn)代植物育種和改良的重要依據(jù)。目前針對(duì)芒屬的群體遺傳學(xué)研究大多針對(duì)芒屬的另外幾個(gè)物種，例如芒、南荻等[8-10]，而針對(duì)荻的群體遺傳學(xué)研究相對(duì)較少，而且大多研究沒(méi)有運(yùn)用群體的取樣策略，不能在群體水平探討遺傳多樣性的相關(guān)問(wèn)題[11]。本研究利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析中國(guó)分布的荻進(jìn)行遺傳多樣性研究，旨在回答以下幾個(gè)問(wèn)題：（1）中國(guó)分布的荻是否存在種下等級(jí)的遺傳分化；（2）其遺傳多樣性水平如何，遺傳分化水平多高；（3）是否存在地理分布格局，地理因素是否是造成遺傳分化的主要原因。

1 材料與方法

1.1 材料的采集

樣品采集自中國(guó)東北三省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、山西、陜西、甘肅、河南、河北、山東等地。樣品采集嚴(yán)格按照群體的取樣策略進(jìn)行，即選擇足夠大的群體，在群體中隨機(jī)選擇有代表性的個(gè)體。由于荻存在克隆繁殖的現(xiàn)象，為了避免取到相同遺傳個(gè)體的不同克隆分株，應(yīng)盡量做到每個(gè)個(gè)體樣品間的距離大于10 m，每個(gè)群體取樣個(gè)體數(shù)目大多為20個(gè)左右，不同群體間的距離大于200 km。選取植株的新鮮葉片置于密封袋中，用硅膠干燥，待完全干燥后放進(jìn)-20 ℃冰箱保存。共選取在地理分布上有代表性的29個(gè)群體的541個(gè)個(gè)體，具體信息見(jiàn)表1。

表1 荻的天然群體信息表

續(xù)表1 荻的天然群體信息表

1.2 DNA提取和微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選

1.2.1 DNA的提取

干燥葉片用CTAB法提取DNA。DNA用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于-80 ℃保存。

1.2.2 SSR引物選擇及PCR擴(kuò)增

在已發(fā)表的相關(guān)文章中[12-13]選取擴(kuò)增條帶清晰單一的20對(duì)引物，在引物5’端增加一個(gè)熒光標(biāo)記（FAM藍(lán)色，HEX綠色，TAMRA紅色）。對(duì)所有的參試個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將1 μL PCR產(chǎn)物、0.6 μL GS500LIZ內(nèi)標(biāo)和8.4 μL Hi-Di甲酰胺均勻混合95 ℃變性5 min后在ABI 3730測(cè)序儀上檢測(cè)，根據(jù)GeneMapper 4.0顯示的電泳峰圖讀取樣品的等位基因。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)每個(gè)群體每個(gè)位點(diǎn)，計(jì)算如下遺傳多樣性參數(shù)：位點(diǎn)平均等位基因數(shù)（mean number of alleles per locus, NA）、平均觀察雜合度（mean observed heterozygosity, Ho）、哈迪-溫伯格平衡下的平均期望雜合度（mean expects heterozygosity,He）、多態(tài)信息含量（polymorphic information content,PIC）。NA、Ho、He參數(shù)的計(jì)算均用PopGene 1.31軟件包完成。PIC的計(jì)算用軟件Powmarker 3.0完成。

在進(jìn)行Structure分析時(shí)，選擇混合模型對(duì)所有群體進(jìn)行分析，burn-in為50萬(wàn)次，MCMC循環(huán)100萬(wàn)次，先設(shè)定K值范圍為1～15，輸入不同的隨機(jī)數(shù)，每個(gè)K重復(fù)計(jì)算10次。用GeneAlex 6.2中的Mantel test來(lái)判斷遺傳變異的分布是否符合距離隔離模型，繪制各個(gè)類群的遺傳距離與地理距離之間的散點(diǎn)圖，判斷遺傳距離與地理距離之間的相關(guān)性。并用SPSS軟件分析群體的遺傳多樣性水平（He）與緯度之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)記多態(tài)性分析

如表2所示，20個(gè)位點(diǎn)整體上表現(xiàn)出較高水平的多樣性，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)為15，其中多樣性較高的m11、M04、m18、D09、d02位點(diǎn)分別有25、40、23、26、29個(gè)等位基因。平均期望雜合度為0.523，其中最小的A39為0.038，最大的d02為0.801。觀察雜合度普遍比期望雜合度略低，平均表現(xiàn)雜合度為0.389。平均多態(tài)信息含量為0.602，范圍在0.015～0.930之間。零等位基因出現(xiàn)的頻率是0.033，其中零等位基因頻率較高的位點(diǎn)有d21、d02，其零等位基因的頻率分別是0.061和0.060，其余位點(diǎn)零等位基因頻率均小于0.06。

表2 標(biāo)記多態(tài)性分析表

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

Structure分析中，最大似然值在K=1～15的范圍內(nèi)持續(xù)升高，沒(méi)有明確的最大值。為了確定最優(yōu)K值，計(jì)算了△K值，發(fā)現(xiàn)在K=3時(shí)，△K出現(xiàn)明顯的峰值，這說(shuō)明參試群體可以大致分為3部分。圖1為K=3時(shí)的Structure分析圖，橫向?yàn)閰⒃嚨妮兜膫€(gè)體，豎直方向?yàn)镼值分布，每份個(gè)體豎向線條最長(zhǎng)色條的顏色決定了該份材料所屬類群。中國(guó)荻的類群可以劃分為3個(gè)亞群，亞群1包括9個(gè)居群，共153個(gè)個(gè)體，主要分布在遼寧、吉林、黑龍江和內(nèi)蒙古自治區(qū)；亞群2包括12個(gè)居群，共238個(gè)個(gè)體，主要分布在河北、陜西、甘肅、山西；亞群3包括8個(gè)居群，共150個(gè)個(gè)體，主要分布在河南、山東、江蘇、安徽、浙江。類群的劃分表現(xiàn)出強(qiáng)烈的地域性，3個(gè)亞群在地理分布上大致分屬于東北地區(qū)、華北地區(qū)和華中地區(qū)。

圖1 Structure分析結(jié)果

2.3 群體的遺傳多樣性水平和遺傳分化分析

如表3所示，無(wú)論是在群體水平還是在類群水平，荻的遺傳多樣性水平普遍較高，而且差異不大，群體水平上的期望雜合度He普遍低于類群水平?？傮w類群水平上He為0.71，Ho為0.53。3個(gè)亞類群中，華北地區(qū)荻的遺傳多樣性水平最高，He為0.58，其次是東北和華北地區(qū)，He分別為0.56和0.53。3個(gè)類群內(nèi)部各個(gè)群體之間遺傳分化水平最高的是東北地區(qū)的荻，遺傳分化系數(shù)Fst是0.17，其次是華北和華中地區(qū)，F(xiàn)st分別是0.09、0.04。Mantel test檢驗(yàn)結(jié)果表明，荻的遺傳距離與地理距離呈顯著的正相關(guān)（r=0.32，P＜0.01），這表明遺傳結(jié)構(gòu)符合地理隔離模型，即地理距離近的群體其遺傳距離也較近，推測(cè)地理隔離因素是造成群體間分化的因素（見(jiàn)圖2）。遺傳多樣性參數(shù)He與緯度的相關(guān)性分析結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3），二者表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.24，P＜0.01），即遺傳多樣性隨緯度的升高而減小，推測(cè)低緯度地區(qū)更加穩(wěn)定而適宜的氣候條件為荻的遺傳分化提供了良好的環(huán)境。

圖2 Mental test分析圖

圖3 遺傳多樣性參數(shù)He與緯度的相關(guān)性分析圖

表3 群體的遺傳多樣性水平和遺傳差異分析表

3 討論

由于芒屬植物作為能源植物的重要應(yīng)用價(jià)值，近年來(lái)針對(duì)芒屬植物的遺傳多樣性研究越來(lái)越多，早期針對(duì)芒屬的群體遺傳學(xué)研究多局限在某個(gè)局部地區(qū)，實(shí)驗(yàn)方法有AFLP、SSR、ITs等。近年來(lái)的群體遺傳學(xué)研究的取樣范圍逐漸擴(kuò)大，涵蓋整個(gè)中國(guó)、日本和韓國(guó)等地區(qū)，隨著測(cè)序技術(shù)和基因組學(xué)的飛速發(fā)展，簡(jiǎn)化基因組測(cè)序（RADseq）等組學(xué)手段被廣泛采用[8-11,14]。但多數(shù)研究是針對(duì)芒屬的芒（M. sinensis），針對(duì)荻的研究相對(duì)較少。Von Wü hlisch等（1994）用同工酶技術(shù)對(duì)芒、荻和三倍體雜交種M.×giganteu做遺傳多樣性分析，大部分同工酶都有很高的變異量，其中變異量最高的等位酶有9種變異式樣[15]。Greef等（1997）用6個(gè)AFLP標(biāo)記調(diào)查了2個(gè)荻個(gè)體、11個(gè)芒個(gè)體和31個(gè)M.×giganteus的遺傳多樣性水平和親緣關(guān)系，在他的研究中荻的遺傳多樣性較低[16]。Clark等（2019）曾用RAD-seq技術(shù)對(duì)荻和相近物種進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，結(jié)果顯示中國(guó)北方荻的遺傳多樣性指標(biāo)SNP diversity（D）為0.139[11]。本研究針對(duì)20個(gè)SSR位點(diǎn)研究了中國(guó)荻29個(gè)群體的遺傳多樣性水平，群體水平遺傳多樣性參數(shù)（He）為0.65。造成各項(xiàng)研究之間荻的遺傳多樣性水平差異的原因，一方面來(lái)自取樣范圍的不同，本研究取樣范圍更廣，基本上能覆蓋其分布范圍；另一方面來(lái)自分子標(biāo)記分辨率的不同，SSR標(biāo)記具有高多變性的特點(diǎn)。

SSR應(yīng)用于禾本科其他重要作物野生種的群體遺傳多樣性研究中，水稻的野生近緣種Oryza rufipogon的He為0.787[17]，大麥的野生近緣種Hordeum spontaneum的He為0.74[18]，玉米的野生近緣種Zea maysssp.mexicana和Zea maysssp.parviglumis的He分別為0.85和0.89[19]。與同屬于禾本科的其他重要作物的野生種相比，荻的遺傳多樣性水平略低，但仍舊保留了較高水平的遺傳多樣性和較高的群體間分化程度。中國(guó)荻的天然群體是育種及遺傳改良最重要的基因庫(kù)，可以為馴化出高產(chǎn)能、高抗性、高耐受性的芒草品種提供豐富的遺傳資源。

本研究中荻不同群體之間表現(xiàn)出較高水平的遺傳分化，而且呈現(xiàn)明顯的地理分布格局，即所有群體可以大致分為3個(gè)亞群，地理分布上分別對(duì)應(yīng)中國(guó)的東北地區(qū)、華北地區(qū)和華中地區(qū)。Mental test分析表明，地理距離與遺傳分化之間呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性，進(jìn)一步說(shuō)明了地理距離是促進(jìn)遺傳分化的重要因素。芒屬另一個(gè)重要物種芒（M.sinensis）的遺傳分化也表現(xiàn)出類似的地理分布格局。Zhao等（2013）用SSR標(biāo)記對(duì)中國(guó)范圍內(nèi)的芒進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示所有個(gè)體被劃分成5個(gè)組分，5個(gè)組分的分布區(qū)存在明顯重疊[9]。Clark等（2014）用RADseq和SSR對(duì)中國(guó)、韓國(guó)和日本的芒進(jìn)行研究，所有個(gè)體被分為6個(gè)組分，其中4個(gè)組分來(lái)自亞洲大陸（中國(guó)東南部、秦嶺-長(zhǎng)江、四川盆地、韓國(guó)和中國(guó)北方），另外2個(gè)組分分布在日本的北部和南部[20]。Li等（2019）用SSR標(biāo)記對(duì)中國(guó)芒屬4個(gè)物種進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究，其中芒可以劃分為北方和南方兩部分[14]。Clark等（2019）在對(duì)荻和相近物種進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析中，荻表現(xiàn)出明顯的多倍化現(xiàn)象，二倍體的荻根據(jù)地理分布可劃分為兩部分，一部分是中國(guó)東北地區(qū)、韓國(guó)和俄羅斯，另一部分分布在中國(guó)北方地區(qū)[11]，與本研究中東北和華北兩個(gè)亞群的地理分布大體一致。但該研究的取樣范圍沒(méi)有包含河南、江蘇、安徽、浙江一帶的荻，因此不能與本研究第三個(gè)亞群（華中地區(qū)的荻）相互印證。芒屬物種的遺傳分化表現(xiàn)出明顯的地理分布格局，這可能與其風(fēng)媒傳粉和較強(qiáng)的抗逆性有關(guān)。