唐紫雯，程華琴，劉冬菊，彭毛卓瑪，楊 雪，李 鍵*，殷 實(shí)*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2.西南民族大學(xué) 現(xiàn)代生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

牦牛()主要生活在青藏高原地區(qū)以及周圍空氣稀薄的高海拔地區(qū)，其肉、皮、骨、角以及糞便能為當(dāng)?shù)鼐用袼?，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但牦牛具有性成熟晚、繁殖率低及繁殖周期長(zhǎng)等劣勢(shì)，嚴(yán)重限制了高原地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展。顆粒細(xì)胞(granulosa cells，GCs)是哺乳動(dòng)物卵巢中一類重要的體細(xì)胞，顆粒細(xì)胞對(duì)于卵巢內(nèi)卵泡和卵母細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要，顆粒細(xì)胞分泌的類固醇激素(如雌二醇和孕酮)和其他多種生長(zhǎng)因子如激活素、TGF-β和SCF等能促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育。此外，顆粒細(xì)胞可以通過(guò)縫隙連接與卵母細(xì)胞傳遞信息，以保證卵母細(xì)胞的正常成熟。因此，顆粒細(xì)胞功能的正常執(zhí)行是母畜完成受孕以及生產(chǎn)的前提條件。

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是體內(nèi)線粒體代謝的正常產(chǎn)物之一。當(dāng)組織和細(xì)胞所產(chǎn)生的ROS超過(guò)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的承載能力時(shí)，氧化平衡被打破，過(guò)量的ROS破壞細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、線粒體和其他重要的細(xì)胞成分，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，刺激端?？s短，對(duì)機(jī)體造成損害進(jìn)而引起病變。環(huán)境污染、外源致病菌毒素、高溫、強(qiáng)紫外線等均能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)是一種由鐮刀菌屬產(chǎn)生具有氧化性的非甾體類真菌毒素，因其最早從發(fā)霉的玉米中分離出來(lái)而得名。ZEA的廣泛污染已經(jīng)成為了全球性問(wèn)題，每年因毒素污染而造成的糧食損失可達(dá)10億噸。ZEA主要會(huì)對(duì)動(dòng)物的消化、免疫、泌尿以及生殖系統(tǒng)等造成損傷。其中，ZEA對(duì)生殖系統(tǒng)的損傷尤為嚴(yán)重，主要通過(guò)如下兩種機(jī)制：1)ZEA能與雌激素受體結(jié)合，干擾類固醇激素的合成與分泌。2)ZEA能上調(diào)ROS水平，損害機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，引起機(jī)體氧化損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，尋找緩解ZEA毒性的方法是目前畜牧養(yǎng)殖行業(yè)一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。

抗氧化劑可以捕獲并結(jié)合氧自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)動(dòng)物生殖系統(tǒng)帶來(lái)的損傷。原花青素(procyanidins, PC)是從植物器官中提取的一種多酚化合物，無(wú)定形粉末，是以不同數(shù)量的兒茶素和表兒茶素為基本結(jié)構(gòu)單元結(jié)合而成的低聚體和多聚體混合物，是國(guó)際公認(rèn)的超強(qiáng)抗氧化劑之一，其抗氧化性比維生素族更強(qiáng)，能更高效地清除機(jī)體內(nèi)的自由基。具有抗炎、抗輻射、抗衰老、抗腫瘤、防治心腦血管疾病和促進(jìn)細(xì)胞增殖等生物學(xué)功能。已有多項(xiàng)研究表明葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins，GSPs)能減輕氧化應(yīng)激對(duì)動(dòng)物生殖系統(tǒng)帶來(lái)的損傷。如GSPs對(duì)沙門菌內(nèi)毒素導(dǎo)致的雞卵巢顆粒細(xì)胞氧化損傷具有一定的緩解作用，能夠回復(fù)沙門菌處理后GSH和T-SOD的表達(dá)水平。王友良的研究表明，原花青素可明顯抑制反式脂肪酸所致小鼠睪丸脂質(zhì)過(guò)氧化損傷作用，提高機(jī)體清除自由基能力，又如原花青素能夠抑制鎘暴露導(dǎo)致的大鼠睪丸組織抗氧化狀態(tài)的改變，降低丙二醛(MDA)、NO和HO的含量，并提高過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(T-SOD)以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性。盡管關(guān)于原花青素抗氧化能力研究方面的文獻(xiàn)眾多，但其在牦牛生殖方面的研究較少，本研究成功分離了牦牛顆粒細(xì)胞，在細(xì)胞及分子層面初步探討了原花青素對(duì)玉米赤霉烯酮誘導(dǎo)牦牛顆粒細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷后細(xì)胞活力、增殖生長(zhǎng)能力、凋亡程度、激素分泌以及抗氧化性的影響，為今后原花青素禽畜育種上的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑：DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶-EDTA消化液(Hyclone)，青霉素-鏈霉素溶液100X(Solarbio)，玉米赤霉烯酮(上海源葉生物科技有限公司)，原花青素(上海麥克林生化有限公司)，Anti-FSHR鼠多克隆抗體(Abcam)，Goat Anti-Mouse IgG (H+L) FITC-conjugate (Affinit)，HE染色試劑盒(Solarbio)，CCK-8試劑盒(MCE)，TRIzol(Invitrogen)，PrimeScriptRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊生物科技有限公司)，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊生物科技有限公司)，?；钚匝?ROS)ELISA試劑盒(鵬世達(dá)生物科技有限公司)，牛雌激素(E)ELISA 檢測(cè)試劑盒(鵬世達(dá)生物科技有限公司)。

主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)，共聚焦顯微鏡(Zeiss)，倒置顯微鏡(Olympus)，超低溫冰箱(Thermo)，定量PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD)，紫外分光光度計(jì)(島津)，超凈工作臺(tái)(Haier)，低溫高速離心機(jī)(Thermo)，渦旋振蕩儀(Stuart)，超純水系統(tǒng)(Milli-Q)，酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.2 牦牛顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)

試驗(yàn)樣品來(lái)自四川省成都市青白江唐家寺牛羊肉供應(yīng)基地，采集3頭年齡在3～5歲，生長(zhǎng)狀況良好，健康的雌性牦牛卵巢，用含1%接近于牦牛體溫的雙抗的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗干凈，置于0.9%生理鹽水的保溫桶中及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室完成后續(xù)處理。在超凈工作臺(tái)中，用10 mL一次性注射器將吸出卵泡液，過(guò)200目細(xì)胞篩。得到濾液，并轉(zhuǎn)移至2 mL微量離心管中，調(diào)整離心機(jī)轉(zhuǎn)速為2 000 r·min，時(shí)間5 min，小心去除上清液，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12將沉淀懸浮起來(lái)，再次以上一步相同條件完成離心，丟棄上清液，向離心管中加入完全培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，測(cè)細(xì)胞活力后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×10個(gè)·mL，吹打至無(wú)明顯沉淀后接種于90 mm培養(yǎng)皿中，于37 ℃，50 mL·LCO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁時(shí)，用PBS清洗，棄去未貼壁的細(xì)胞及其他雜質(zhì)，注意保持整個(gè)過(guò)程的無(wú)菌環(huán)境及條件。使用胰蛋白酶消化細(xì)胞并接種至一個(gè)新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，之后每隔一段時(shí)間進(jìn)行清洗，換液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 顆粒細(xì)胞蘇木素-伊紅(HE)染色及顆粒細(xì)胞免疫熒光染色

使用酒精棉球?qū)Ｓ玫募?xì)胞爬片上的雜質(zhì)擦除干凈，用75%酒精浸泡48 h，再使用PBS洗去殘余酒精，并輕放到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取出80%匯合度的細(xì)胞爬片，PBS洗去培養(yǎng)液及其他雜質(zhì)后，加入4%多聚甲醛(PFA)固定爬片20 min，洗去多聚甲醛，按照HE試劑盒要求進(jìn)行染色，根據(jù)具體情況調(diào)整染色時(shí)間，爬片干燥后中性樹(shù)膠固封并鏡下觀察。以同樣的方法制得細(xì)胞爬片，加入500 μL 0.5% Triton X-100透膜液透膜20 min后，再用磷酸鹽緩沖液清洗3次，在室溫條件下，用1 mL 5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液封閉1 h，取出蓋玻片，置于稀釋了200倍的特異性抗體Anti-FSHR鼠多克隆抗體中，于4 ℃冰箱中過(guò)夜，之后，使用PBS清洗玻片3次，每次2 min，風(fēng)干片刻后，滴加500 μL用PBS稀釋了300倍的對(duì)應(yīng)二抗Goat Anti-Mouse IgG (H+L) FITC-conjugate，室溫避光環(huán)境中孵育1 h，DAPI染色封片并用共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。

1.4 顆粒細(xì)胞活力檢測(cè)

用培養(yǎng)基將牦牛顆粒細(xì)胞的密度設(shè)置為1×10個(gè)·mL，在無(wú)菌條件下接種于96孔板，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)12 h后，設(shè)置空白對(duì)照組(Control)：更換培養(yǎng)12 h的培養(yǎng)基，新的培養(yǎng)基中不添加ZEA和PC，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)24 h。設(shè)置ZEA處理組：更換培養(yǎng)12 h的牦牛顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基，在新的培養(yǎng)基中添加不同濃度的ZEA，使其最終濃度為0、5、10、20、40、60、80和100 μmol·mL，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)24 h。設(shè)置PC處理組：更換培養(yǎng)12 h的牦牛顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基，更換新的培養(yǎng)基并添加不同濃度的PC，使其最終濃度為0、0.05、0.5、2.5、5、10、50和100 μg·mL，37 ℃，50 mL·LCO培養(yǎng)24 h。設(shè)置ZEA + PC聯(lián)合處理組：更換培養(yǎng)12 h的牦牛顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基，在新的培養(yǎng)基中添加50 μmol·mLZEA+5 μg·mLPC，該組與氧化損傷組和PC組以相同的培養(yǎng)條件完成培養(yǎng)。在每個(gè)孔添加10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)2 h，測(cè)定OD，記錄結(jié)果，遮蓋培養(yǎng)板避光室溫保存，可多次測(cè)定吸光度，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)所示公式計(jì)算細(xì)胞活力，進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5 顆粒細(xì)胞總RNA提取、cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的液體棄去，用PBS洗凈培養(yǎng)液后，加入1 mL冰冷TRIzol反復(fù)沖洗培養(yǎng)皿以獲得足夠多的細(xì)胞。收集該液體至1.5 mL無(wú)酶離心管中，室溫靜置5 min，接下來(lái)的步驟嚴(yán)格按照TRIzol法進(jìn)行提取RNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度，為挑選濃度和純度合格的樣品，選擇在OD與OD的比值處于1.8到2.0之間且OD與OD大于2.0的RNA樣本進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將得到的顆粒細(xì)胞RNA通過(guò)PrimeScriptRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按說(shuō)明書(shū)采用兩步法反轉(zhuǎn)錄，第一步反應(yīng)條件：42 ℃ 2 min，第二步反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，將得到的cDNA進(jìn)行濃度及質(zhì)量檢測(cè)后于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布瘤牛()的相關(guān)基因序列，通過(guò)NCBI中的Pick Primers在線完成引物的設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒檢測(cè)牦牛顆粒細(xì)胞中各基因的表達(dá)情況，RT-qPCR反應(yīng)體系為15 μL：模板及上、下游引物分別1 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5 μL，ddHO 4.5 μL。RT-qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，重復(fù)執(zhí)行該流程，保證每個(gè)樣本重復(fù)3次。qPCR所得Ct值通過(guò)2法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)，使用SPSS 21.0對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行方差分析。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences of qRT-PCR

1.6 顆粒細(xì)胞ROS水平檢測(cè)

收集空白對(duì)照組(Control)、添加50 μmol·mLZEA處理組及50 μmol·mLZEA+5 μg·mLPC聯(lián)合處理組培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)液3 000 r·min離心10 min，小心吸取得到上清液。按照?；钚匝?ROS)ELISA檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)顆粒細(xì)胞活性氧水平，迅速使用酶標(biāo)儀依次測(cè)定各樣本在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入數(shù)值完成結(jié)果的計(jì)算。

1.7 雌二醇(estradiol，E2)濃度檢測(cè)

收集空白對(duì)照組(Control)、添加50 μmol·mLZEA處理組及50 μmol·mLZEA+5 μg·mLPC聯(lián)合處理組培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)液3 000 r·min離心10 min，取上清液備用。使用牛雌激素(E)ELISA 檢測(cè)試劑盒完成E濃度的檢測(cè)，依次測(cè)定在450 nm下各樣本的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，代入數(shù)值完成結(jié)果的計(jì)算。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件處理，采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為Student’s unpaired t-test，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以“mean±SEM”的方式表示，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛顆粒細(xì)胞的分離與鑒定

接種牦牛顆粒細(xì)胞幾個(gè)小時(shí)后一部分細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)，原代細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，且分布不均勻，細(xì)胞傳代培養(yǎng)后生長(zhǎng)迅速，且生長(zhǎng)形態(tài)更好。為了檢測(cè)本研究分離培養(yǎng)得到的細(xì)胞的純度，保證后續(xù)研究對(duì)象的準(zhǔn)確性，對(duì)牦牛顆粒細(xì)胞進(jìn)行了HE染色，染色情況如圖1A所示，顆粒細(xì)胞形態(tài)大多呈梭形，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。免疫熒光染色后的結(jié)果表明，所分離得到的細(xì)胞能夠表達(dá)顆粒細(xì)胞特異性卵泡刺激素受體(follicle stimulating hormone receptor, FSHR)(圖1B)，證明本次用于試驗(yàn)的細(xì)胞為純度較高的顆粒細(xì)胞。

A.不同放大倍數(shù)牦牛顆粒細(xì)胞HE染色；B.牦牛顆粒細(xì)胞FSHR的免疫熒光染色A.HE staining in yak granulosa cells at different magnifications; B. Immunofluorescent staining of FSHR in yak granulosa cells 圖1 牦牛顆粒細(xì)胞的鑒定Fig.1 Identification of yak granulosa cells

2.2 ZEA和PC對(duì)顆粒細(xì)胞活力的影響

設(shè)立不同濃度的ZEA添加到顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中，檢測(cè)細(xì)胞活力后結(jié)果顯示，在0～100 μmol·mL的范圍內(nèi)隨著ZEA濃度增高顆粒細(xì)胞活力越低(<0.01，圖2)，以此為基礎(chǔ)計(jì)算出ZEA的半數(shù)抑制濃度為50 μmol·mL，并以此濃度處理牦牛顆粒細(xì)胞建立氧化損傷模型。同樣的，應(yīng)用CCK-8法測(cè)定不同濃度PC對(duì)顆粒細(xì)胞相對(duì)存活率的影響來(lái)確定后續(xù)研究的適宜濃度，由圖3可知，當(dāng)PC濃度小于2.5 μg·mL時(shí)，與未添加PC組顆粒細(xì)胞的活力相比沒(méi)有顯著影響，隨著濃度的上升，PC對(duì)顆粒細(xì)胞的活力有顯著提高作用，且在濃度為5 μg·mL時(shí)提高細(xì)胞活力的作用最明顯，提高了19.1%(<0.01)，但隨著PC濃度的升高，顆粒細(xì)胞的活力逐漸降低，因此本研究后續(xù)設(shè)定PC濃度為5 μg·mL來(lái)研究PC對(duì)經(jīng)ZEA損傷的顆粒細(xì)胞的保護(hù)作用。

設(shè)定對(duì)照組為1，其他組別均與對(duì)照組做比較，數(shù)據(jù)表示為 “平均值±SEM ”，n=3， *表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同The control group was set as 1, and all other groups were compared with the control group, * indicated significant difference (P<0.05), Data were presented as “mean±SEM”, n=3, ** indicated extremely significant difference (P<0.01), the same as below圖2 不同濃度ZEA處理24 h后牦牛顆粒細(xì)胞的活力Fig.2 The viability of yak granulosa cells treated with different concentrations of ZEA for 24 h

圖3 不同濃度PC處理24 h后牦牛顆粒細(xì)胞的細(xì)胞活力Fig.3 The viability of yak granulosa cells treated with different concentrations of PC for 24 h

2.3 ZEA與PC聯(lián)合處理后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響

ZEA對(duì)顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，與ZEA組相比，ZEA + PC聯(lián)合處理組顆粒細(xì)胞數(shù)量增加(圖4A)。經(jīng)CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與ZEA組相比，ZEA + PC聯(lián)合處理組顆粒細(xì)胞活力顯著增加了56.5%(<0.01，圖4B)。

A. ZEA與PC聯(lián)合處理24 h后牦牛顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)(40×)；B. ZEA與PC聯(lián)合處理24 h后牦牛顆粒細(xì)胞的活力A. The growth situation of yak granulosa cells with the combined treatment of ZEA and PC for 24 h(40×); B. The viability of yak granulosa cells with the combined treatment of ZEA and PC for 24 h圖4 ZEA與PC聯(lián)合處理后對(duì)牦牛顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響Fig.4 The effect of combined treatment of ZEA and PC on the viability of yak granulosa cells

2.4 ZEA與PC聯(lián)合處理后對(duì)顆粒細(xì)胞增殖以及凋亡相關(guān)基因的影響

添加ZEA后，與對(duì)照組相比顆粒細(xì)胞中與細(xì)胞增殖相關(guān)基因和生長(zhǎng)相關(guān)基因-II mRNA的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(<0.01)，分別下調(diào)了67.3%和52.1%。而與ZEA處理組相比，ZEA+PC聯(lián)合處理組這兩種基因的mRNA表達(dá)水平有極顯著上升(<0.01)，分別上升了78.3%和35.7%(圖5A、5B)。與對(duì)照組相比，ZEA處理組中顆粒細(xì)胞中抑凋亡相關(guān)基因和-2 mRNA的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(<0.01)，分別下調(diào)了52.2%和59.2%。而ZEA + PC聯(lián)合處理組這兩種基因的表達(dá)水平與ZEA組相比顯著上調(diào)(<0.05)，分別上調(diào)了44.5%和49.5%(圖5C、5D)。與對(duì)照組相比，ZEA處理組中顆粒細(xì)胞中與促凋亡相關(guān)基因和3 mRNA的表達(dá)水平極顯著上調(diào)(<0.01)，分別上調(diào)了241.8%和55.0%。而ZEA + PC聯(lián)合處理組這兩種基因的表達(dá)水平與ZEA組相比有所下調(diào)，其中mRNA的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(<0.01)，下調(diào)了35.2%，3 mRNA的表達(dá)水平顯著下調(diào)(<0.05)，下調(diào)了17.1%(圖5E、5F)。

A～B.顆粒細(xì)胞中增殖生長(zhǎng)相關(guān)基因PCNA和 IGF-Ⅱ mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；C～D.顆粒細(xì)胞中抑凋亡相關(guān)基因XIAP和BCL-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；E～F. 顆粒細(xì)胞中促凋亡相關(guān)基因BAX 和 CASP3 mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平A-B. The relative mRNA expression levels of proliferation and growth-related genes PCNA and IGF-II in granulosa cells; C-D. The relative mRNA expression levels of the anti-apoptotic genes XIAP and BCL-2 in granulosa cells; E-F.The relative mRNA expression levels of pro-apoptotic genes BAX and CASP3 in granulosa cells圖5 ZEA + PC聯(lián)合處理后牦牛顆粒細(xì)胞24 h后增殖和凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平Fig.5 The expression levels of proliferation and apoptosis-related genes in yak granulosa cells after 24 h with the combined treatment of ZEA+PC

2.5 ZEA與PC聯(lián)合處理后對(duì)顆粒細(xì)胞抗氧化能力的影響

結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ZEA處理組ROS水平顯著升高了20.7%(<0.05)。而與ZEA處理組相比，ZEA+PC聯(lián)合處理組顆粒細(xì)胞的ROS水平顯著降低了11.5%(<0.05，圖6A)。對(duì)顆粒細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加ZEA培養(yǎng)后，與對(duì)照組相比，顆粒細(xì)胞中抗氧化基因2、1及的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(<0.01)，分別下調(diào)了24.5%、63.8%和14.7%。而與ZEA組相比，ZEA + PC聯(lián)合處理組顆粒細(xì)胞中這些抗氧化基因mRNA的表達(dá)水平均極顯著上調(diào)(<0.01)，分別上調(diào)了24.4%、68.2%和14.1%(圖6B～6D)。

A.顆粒細(xì)胞ROS相對(duì)水平；B～D.部分顆粒細(xì)胞抗氧化基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平A. The relative levels of ROS in granulosa cells; B-D. The relative mRNA expression levels of some antioxidant-related genes in granulosa cells圖6 ZEA與PC聯(lián)合處理后對(duì)牦牛顆粒細(xì)胞抗氧化能力的影響Fig.6 The effect of combined treatment of ZEA and PC on the antioxidant capacity of yak granulosa cells

2.6 ZEA與PC聯(lián)合處理后對(duì)顆粒細(xì)胞E2分泌水平的影響

測(cè)定顆粒細(xì)胞的E分泌水平后，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，ZEA組顆粒細(xì)胞分泌的E水平顯著降低(<0.05)，降低了13.4%。而與ZEA組相比，ZEA+PC聯(lián)合處理組顆粒細(xì)胞E分泌水平顯著上升(<0.05)，上升了18.7%(圖7A)。為了探究ZEA與PC對(duì)顆粒細(xì)胞E合成相關(guān)基因的影響，檢測(cè)了部分顆粒細(xì)胞E合成相關(guān)基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，ZEA組顆粒細(xì)胞中與E合成相關(guān)基因、11A1及3B mRNA的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(<0.01)，分別下調(diào)了87.9%、64.1%和34.8%。而與ZEA組相比，ZEA+PC聯(lián)合處理組中這些基因的表達(dá)水平有所上升，其中及11A1 mRNA的表達(dá)水平極顯著上調(diào)(<0.01)，分別上調(diào)了94.6%和85.8%(圖7B、7C)，3B mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)(<0.05)，上調(diào)了30.6%(圖7D)。

A.顆粒細(xì)胞E2相對(duì)分泌水平; B～D.部分顆粒細(xì)胞E2合成相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平A.The relative secretion levels of E2 in granulosa cells; B-D. The relative mRNA expression levels of some E2 synthesis-related genes圖7 ZEA與PC聯(lián)合處理后對(duì)牦牛顆粒細(xì)胞分泌E2的影響Fig.7 Effect of the combined treatment of ZEA and PC on the secretion of E2 by yak granulosa cells

3 討 論

卵巢是雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)的重要組成部分，顆粒細(xì)胞是卵巢卵泡內(nèi)包圍在卵母細(xì)胞周圍的一類非常重要的體細(xì)胞。其主要功能是分泌雌激素、促進(jìn)卵泡的生長(zhǎng)、發(fā)育及成熟，在母畜受孕生產(chǎn)中有著重要作用。因此，維持顆粒細(xì)胞功能的正常執(zhí)行是提高動(dòng)物繁殖能力的重要手段之一。

本研究發(fā)現(xiàn)ZEA處理顆粒細(xì)胞后細(xì)胞的活力降低，ROS水平上升且部分抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，而雌激素合成的能力下降，表明ZEA對(duì)牦牛顆粒細(xì)胞造成氧化損傷性并抑制了雌激素的合成。

已有多篇文獻(xiàn)研究了ZEA的氧化損傷作用和雌激素樣作用，如高鑫研究表明，ZEA及其代謝物能夠?qū)θ祟惡蛣?dòng)物的生殖、消化、免疫系統(tǒng)等方面造成氧化損傷，從而影響機(jī)體的正常生長(zhǎng)，甚至誘發(fā)癌癥；而向妊娠期雌性大鼠灌胃ZEA，導(dǎo)致體內(nèi)雌二醇水平下降，干擾雌激素信號(hào)通路，導(dǎo)致生殖系統(tǒng)紊亂。本試驗(yàn)檢測(cè)了不同濃度的PC對(duì)牦牛顆粒細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明，PC濃度為5 μg·mL時(shí)提高細(xì)胞活力的作用最明顯，但濃度高于50 μg·mL后，PC會(huì)顯著降低顆粒細(xì)胞的活性。在其他研究中也有類似的結(jié)果，例如有研究發(fā)現(xiàn)在人體白細(xì)胞內(nèi)，同樣作為抗氧化劑的槲皮素當(dāng)其濃度低于50 mmol·L時(shí)，顯示抗氧化活性，但濃度超過(guò)100 mmol·L時(shí)，DNA氧化損傷顯著增加，損害細(xì)胞活力。有研究指出，當(dāng)對(duì)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)線粒體過(guò)氧化氫酶后，發(fā)現(xiàn)可降低體內(nèi)HO含量，并阻斷細(xì)胞由G0期向G1期的轉(zhuǎn)變，證明低劑量的ROS在調(diào)控細(xì)胞分裂中具有積極作用。由此推測(cè)，在本次試驗(yàn)中當(dāng)PC濃度高于50 μg·mL時(shí)，ROS水平低于機(jī)體正常運(yùn)轉(zhuǎn)所需最低ROS水平，細(xì)胞正常功能受到影響，反而產(chǎn)生降低細(xì)胞活力的效果。由此可知，PC作為抗氧化劑作用于顆粒細(xì)胞應(yīng)控制在一定的濃度范圍內(nèi)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，ZEA與PC聯(lián)合處理組顆粒細(xì)胞與ZEA氧化損傷組相比，細(xì)胞的活力極顯著上升，說(shuō)明ZEA對(duì)PC誘導(dǎo)牦牛顆粒細(xì)胞活力下降具有明顯的緩解作用。

機(jī)體為了應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，除了保證體內(nèi)抗氧化酶和抗氧化性物質(zhì)的正常合成以外，外源性補(bǔ)充生物活性物質(zhì)或抗氧化劑也是減緩氧化應(yīng)激的重要途徑。PC是一類生物類黃酮，屬于天然植物提取類的抗氧化劑。而本研究也證實(shí)，適宜濃度的PC能夠促進(jìn)牦牛顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)，下調(diào)顆粒細(xì)胞ROS水平。在ZEA與PC聯(lián)合處理牦牛顆粒細(xì)胞后，顆粒細(xì)胞活性氧水平與ZEA單獨(dú)處理組相比顯著下降，顆粒細(xì)胞活力得到顯著提高，相關(guān)基因的表達(dá)水平得到恢復(fù)，因此，本研究推測(cè)，PC可能是通過(guò)降低ZEA誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞后的活性氧水平，降低顆粒細(xì)胞凋亡程度，進(jìn)而提升了細(xì)胞的活力。這與其他文獻(xiàn)中所報(bào)道的結(jié)果一致，如有研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素B2(GSPB2)能夠提升被HO氧化損傷的豬顆粒細(xì)胞活力，這一作用是通過(guò)提高-2/比值，降低3 mRNA的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)的。原花青素B1(PB1)處理MII 卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞后，降低了細(xì)胞ROS 的產(chǎn)生和凋亡水平，并且增加了GSH水平。

顆粒細(xì)胞所分泌的E在卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞發(fā)育的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)雌性動(dòng)物生殖能力的維持具有重要意義。而在E合成過(guò)程中主要受到、11A1及3B三種關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)作用。體外研究發(fā)現(xiàn)，ZEA及其代謝物在體外抑制牛小卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞增殖和類固醇生成。在Barbe等的研究中發(fā)現(xiàn)GSPB2能夠通過(guò)提高人顆粒細(xì)胞STAR蛋白的表達(dá)水平進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分泌孕酮和雌激素。在本研究中，添加ZEA后牦牛顆粒細(xì)胞E分泌水平顯著降低，而添加PC后，E水平以及相關(guān)基因的表達(dá)都得到了一定的恢復(fù)，推測(cè)PC可能通過(guò)促進(jìn)、11A1及3B mRNA的表達(dá)進(jìn)而提高顆粒細(xì)胞分泌E的能力。

4 結(jié) 論

牦牛顆粒細(xì)胞培養(yǎng)基中添加ZEA會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，細(xì)胞活力下降，ROS水平上升，E分泌水平下降。PC能夠減緩ZEA引起的一系列細(xì)胞功能如生長(zhǎng)增殖、氧化應(yīng)激及雌激素分泌水平等，恢復(fù)細(xì)胞功能。本試驗(yàn)表明適宜濃度PC能夠改善牦牛顆粒細(xì)胞的生存環(huán)境，提升顆粒細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的抗性以及雌激素的分泌能力，減少ROS帶來(lái)的氧化損傷。