曹夢園，陳明杰，王晨豫，李益濤，閆雪琪，陳 杰，齊亞銀

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000)

糞腸球菌是一種常見革蘭陽性球菌，廣泛存在于環(huán)境及動物的消化道內(nèi)。目前，糞腸球菌耐藥逐漸增強(qiáng)，已經(jīng)成為一種公認(rèn)的條件性致病菌，常引起人的尿路感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和手術(shù)腹腔感染等疾病。近幾年，糞腸球菌耐藥性逐漸增強(qiáng)，由糞腸球菌引起的動物腦膜炎病例逐漸增多，已成為一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，給畜牧業(yè)的發(fā)展帶來巨大的影響。

實(shí)驗(yàn)室前期已分離到可致腦膜炎的糞腸球菌，本試驗(yàn)選取1株糞腸球菌(命名為XJ 6)作為試驗(yàn)株，以小鼠為實(shí)驗(yàn)動物，建立腦組織損傷模型，通過常規(guī)石蠟切片及HE染色，動態(tài)觀察腦組織的病理學(xué)變化，采集不同感染時期與空白對照組小鼠腦組織做差異性表達(dá)分析，進(jìn)一步豐富糞腸球菌引起腦組織損傷的機(jī)制。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)動物及菌株

8周齡清潔級昆明鼠50只(22～25 g，購自達(dá)爾文生物科技有限公司)，致腦膜炎糞腸球菌由本實(shí)驗(yàn)室前期分離并保存。

1.2 主要試劑及儀器

總RNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；全自動酶標(biāo)儀購自美國BioTek儀器；ND2000 微量核酸蛋白分析儀購自美國Nanodrop。

1.3 腦組織病理學(xué)觀察

1.3.1 細(xì)菌的復(fù)蘇與毒力基因檢測 取實(shí)驗(yàn)室前期保存的致腦膜炎糞腸球菌，編號為XJ6，復(fù)蘇純化后提取其DNA，除前期已檢測的毒力基因外，設(shè)計(jì)了等10個毒力因子的引物。引物序列如表1所示。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.2 樣品的采集及石蠟切片的制作 參考李慧等的方法，測定細(xì)菌的半數(shù)致死量LD，選擇XJ 6株的2/3 LD為感染劑量，對小鼠進(jìn)行腹腔注射，并注射相同劑量生理鹽水作為空白對照。選取注射后2、4、6、12、24、36、60和72 h的小鼠，采集小鼠腦組織按照石蠟切片說明書進(jìn)行制作。

1.4 感染細(xì)菌后小鼠腦組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異分析

1.4.1 總RNA的提取及質(zhì)量檢測 選擇感染糞腸球菌后癥狀早期、癥狀明顯期和轉(zhuǎn)歸期3個時間點(diǎn)(12、24、60 h)與空白對照小鼠的腦組織，提取上述腦組織RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性；使用Nano Photometer spectrophotometer儀器檢測來RNA純度；通過Agilent 2100 bioanalyzer生物分析儀來精確檢測RNA完整性。

1.4.2 mRNA文庫的構(gòu)建 通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA。按照NEB普通建庫方式或鏈特異性建庫方式進(jìn)行建庫。使用Qubit2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量，使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫的insert size進(jìn)行檢測，qRT-PCR對文庫有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

1.4.3 差異表達(dá)基因富集分析 比較在用XJ6號株進(jìn)行腹腔注射后12、24、60 h和空白處理組之間的基因表達(dá)差異，對差異性表達(dá)基因開展GO和KEGG通路富集分析。

1.5 熒光定量PCR驗(yàn)證

根據(jù)測序結(jié)果，從轉(zhuǎn)錄組差異性表達(dá)的文庫篩選在12、24和60 h均上調(diào)和下調(diào)的基因利用NCBI上及公布的基因序列在NCBI上或primerbank，設(shè)計(jì)上調(diào)基因2-3、10、8b、5、32、2-6、10、、3的引物，下調(diào)基因7、17、33、111、12、1、6、、2、1的引物，并選擇-為內(nèi)參，測定各個基因的表達(dá)量，用SPASS 22軟件進(jìn)行差異顯著性分析。引物序列如表2和表3所示。

表2 上調(diào)基因引物序列表Table 2 Sequence table of up-regulated gene primers

表3 下調(diào)基因引物序列表Table 3 Sequence table of down-regulated gene primers

熒光定量檢測的程序?yàn)?5 ℃ 10 min；94 ℃ 90 s，梯度PCR挑選的合適溫度15 s，72 ℃ 90 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min；體系為LightCycler 480 SYBR Green I Master 10 μL、dd HO 7 μL、上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

2 結(jié) 果

2.1 PCR鑒定

對XJ 6糞腸球菌使用糞腸球菌毒力因子檢測結(jié)果表明、、、、、、、八個毒力因子基因?yàn)殛栃?，如圖1所示。

M. 2000 Plus DNA相對分子質(zhì)量；1. sprE；2. Ebp；3. hyp；4. SrtA；5. gls；6. nuc；7. psaA；8. Cbh；9. CPS；10. fsrM. 2000 Plus DNA marker；1. sprE；2. Ebp；3. hyp；4. SrtA；5. gls；6. nuc；7. psaA；8. Cbh；9. CPS；10. fsr圖1 毒力因子檢測電泳圖Fig.1 Electrophoresis of virulence factor detection

2.2 HE染色觀察

如圖2所示：圖2A、B為PBS處理組，小鼠腦組織的腦膜及腦實(shí)質(zhì)神經(jīng)元均未見異常病變。感染糞腸球菌后，在12 h時病理變化如圖2C～E所示，腦膜及腦實(shí)質(zhì)血管充血，血管周圍的間隙明顯增大，因水腫腦組織間隙增寬。在24 h時腦組織的病變?nèi)鐖D2F、G所示，腦組織血管充血，因水腫腦組織呈網(wǎng)格狀間隙，細(xì)胞排列紊亂，微血栓的形成。在48 h時病理變化如圖2H、I所示，表現(xiàn)為腦血管充血，腦組織見網(wǎng)格狀間隙，膠質(zhì)細(xì)胞增生。在60 h時病理變化如圖2J、K所示，少數(shù)神經(jīng)細(xì)胞周圍出現(xiàn)空白間隙。在72 h時病理變化如圖2L所示，細(xì)胞形態(tài)逐步恢復(fù)正常，排列相對整齊，部分神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)正常。

A、B.PBS組，腦膜未見異常；C～E.12 h處理組，腦膜充血，血管周圍間隙增大；F、G.24 h處理組，水腫腦組織呈網(wǎng)格狀間隙，細(xì)胞排列紊亂；H、I.48 h處理組，腦血管充血，膠質(zhì)細(xì)胞增生；J、K.60 h處理組，神經(jīng)細(xì)胞周圍出現(xiàn)空白間隙；L.72 h處理組，部分神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)正常A,B.PBS group, no abnormality in meninges; C-E.12 h action group, meningeal hyperemia, enlarged perivascular spaces; F,G.24 h action group, edema brain tissue with grid-like gaps and disordered arrangement of cells; H,I.48 h action group, cerebral vascular congestion, gliosis; J,K. 60 h action group, Empty gaps appear around nerve cells; L.72 h action group, Some nerve cells return to normal圖2 剖檢和石蠟切片(B,100×; D～L,400×)觀察結(jié)果Fig.2 Observation results of autopsy and paraffin section graphs (B,100×; D-L,400×)

2.3 總RNA的提取及純度和質(zhì)量檢測結(jié)果

使用1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓：180 V，時間16 min，如圖3所示，均顯示清晰完整條帶。經(jīng)Nano Drop 2000量分光光度計(jì)測定，OD/OD均為1.81～1.90，且檢測其Agilent 2100 bioanalyzer檢測其完整性結(jié)果其評分均為8.90～9.40，評分為A。

M. Trans 2K Plus DNA相對分子質(zhì)量；1～3. 空白對照組；4～6. 12 h處理組；7～9. 24 h處理組；10～12. 60 h處理組M. Trans 2K Plus DNA marker；1-3. Blank control group；4-6. The 12 h treatment group；7-9. The 24 h treatment group；10-12. The 60 h treatment group圖3 總RNA質(zhì)檢圖Fig.3 Total RNA quality chart

2.4 差異表達(dá)情況

與對照組相比12 h時有810個基因上調(diào)表達(dá)，768個基因下調(diào)表達(dá)，24 h時有1 733個基因上調(diào)表達(dá)，2 551個基因下調(diào)表達(dá)，60 h時有197個基因上調(diào)表達(dá)，118個基因下調(diào)表達(dá)。

2.5 差異表達(dá)基因GO富集情況

通過 GO 富集分析，可以得知在12 h時主要富集到對β干擾素的反應(yīng)、對γ干擾素的反應(yīng)、對細(xì)菌的防御反應(yīng)、對凋亡信號通路的調(diào)節(jié)和一些與線粒體相關(guān)的細(xì)胞組成等較為突出的46個生物進(jìn)程，33個細(xì)胞組成和2個分子功能中。24 h時主要富集到分化的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生的調(diào)控、外在凋亡信號通路、血管生成等較為突出的641個生物進(jìn)程，98個細(xì)胞組成和68個分子功能中。60 h時主要富集到對細(xì)菌的防御反應(yīng)、對其他生物的防御反應(yīng)、對革蘭陽性細(xì)菌的防御反應(yīng)、細(xì)胞對γ和β干擾素的反應(yīng)等較為突出的13個生物進(jìn)程，16個細(xì)胞組成和4個分子功能中。

從12、24和60 h與對照組相比GO富集分析結(jié)果中選取最顯著的30個Term繪制氣泡圖進(jìn)行展示，如圖4所示。

A.12 h GO富集部分重要結(jié)果圖；B.24 h GO富集部分重要結(jié)果圖；C. 60 h GO富集部分重要結(jié)果圖A. Some important results of 12 h GO enrichment； B. Some important results of 24 h GO enrichment; C. Some important results of 60 h GO enrichment圖4 差異性表達(dá)基因GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

2.6 差異表達(dá)基因KEGG富集結(jié)果

KEGG富集結(jié)果顯示(圖5)，12 h較顯著富集的信號通路富集過氧物酶體、NOD樣受體信號通路和氧化磷酸化3條信號通路上。24 h時主要富集到鈣代謝信號傳導(dǎo)途徑、PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑、Wnt信號通路、MAPK信號通路、GnRH分泌、VEGF信號通路、緊密連接等一些與血腦屏障損傷相關(guān)的通路上。60 h時主要富集到抗原的處理和呈遞、細(xì)胞黏附分子CAMs等信號通路上。

(圖5)(Fig.5 Continued on the next page)

A.12 h KEGG富集結(jié)果圖；B.24 h KEGG富集結(jié)果圖；C.60 h KEGG富集結(jié)果圖A. 12 h KEGG enrichment result graph; B. 24 h KEGG enrichment results; C. 60 h KEGG enrichment result graph圖5 差異性表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.7 q-PCR驗(yàn)證

上調(diào)的基因中：在12 h時2-6、2-3、8b、10、5、10、32、和3基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)完全一致，在24 h時2-6、2-3、5、10、32、和3基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)一致；在60 h時2-3、10、5、10、32、和3基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)一致。具體結(jié)果如圖6A和B所示。下調(diào)的基因中：在12 h時111、1、12、、1、17、2和7基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)一致。在24和60 h時所選的基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)基本一致。具體結(jié)果如圖6C和D所示。

圖6 差異性表達(dá)基因q-PCR驗(yàn)證Fig.6 q-PCR validation of differentially expressed genes

3 討 論

糞腸球菌是人和動物消化道的正常菌群之一，一般不引起疾病的發(fā)生。目前，糞腸球菌耐藥逐漸增強(qiáng)，已經(jīng)成為一種公認(rèn)的條件性致病菌，常引起人的尿路感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、化膿性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和手術(shù)腹腔感染等疾病。

本研究選取實(shí)驗(yàn)室前期分離到的糞腸球菌(XJ 6)，對其LD和毒力基因進(jìn)行了檢測，除實(shí)驗(yàn)室前期檢測到的毒力因子esp、gelE、CylA、asal、asa373、ace、efa、EF0591和EF3314外，XJ6株還檢出了sprE、Ebp、hyp、SrtA、gls、psaA、Cbh、fsr 8個毒力因子。以2/3 LD為感染劑量，選取小鼠攻毒后12、24、48、60、72 h及空白對照組的腦組織進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，小鼠腦組織先后出現(xiàn)了血管充血，血管周圍的間隙明顯增大，腦組織水腫、細(xì)胞排列較亂、膠質(zhì)細(xì)胞增生、微血栓形成及炎性細(xì)胞浸潤，與李慧等的研究結(jié)果基本一致。在半數(shù)致死量上，本次研究菌株的半數(shù)致死量與黎滿香等和王玉峰等的研究結(jié)果相差較大，這可能與菌株的來源和保存年限有一定的關(guān)系。

在基因的差異性表達(dá)中，與對照組相比，小鼠攻毒12 h時有810個基因上調(diào)表達(dá)，768個基因下調(diào)表達(dá)，攻毒24 h時有1 733個基因上調(diào)表達(dá)，2 551個基因下調(diào)表達(dá)，攻毒60 h時有197個基因上調(diào)表達(dá)，118個基因下調(diào)表達(dá)。GO富集分析得到在12 h時β干擾素的反應(yīng)以及對細(xì)菌的防御反應(yīng)和一些凋亡調(diào)控等，Rasouli等的研究表明，β干擾素可以作用于單核細(xì)胞，從而改善中樞系統(tǒng)的自身免疫，說明在攻毒12 h時，腦部對細(xì)菌的侵襲產(chǎn)生了防御作用。24 h時則主要集中在一些凋亡和細(xì)胞遷移以及血管合成等，權(quán)瑜等的研究表明相關(guān)通路表達(dá)與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷有關(guān)。60 h時主要集中在對細(xì)菌的防御反應(yīng)、對其他生物的防御反應(yīng)和對革蘭陽性細(xì)菌的防御反應(yīng)以及細(xì)胞對干擾素-γ和β的反應(yīng)，表明此時腦組織主要是以抵御糞腸球菌為主，從而減輕其對腦組織的傷害。通過KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)在12 h時主要富集到過氧化物酶體、NOD樣受體信號通路和氧化磷酸化上，有很多的研究結(jié)果表明這三條通路與腦損傷有關(guān)。24 h時主要富集到很多與血腦屏障損傷相關(guān)的通路及損傷指示的一些通路上，例如PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑、鈣代謝信號傳導(dǎo)途徑。60 h時主要富集到抗原的處理和呈遞和細(xì)胞黏附分子的一些通路上。

目前，熒光定量檢測技術(shù)已經(jīng)在檢測基因的表達(dá)和基因含量上被廣泛應(yīng)用。在很多癌癥上也可以應(yīng)用熒光定量檢測技術(shù)檢測原癌基因和抑癌基因的表達(dá)量，從而反映出機(jī)體患癌的可能性。對于轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)而言，目前，有Western blot驗(yàn)證、Northern blot驗(yàn)證和qRT-PCR驗(yàn)證三種方式，本研究選擇qRT-PCR驗(yàn)證的方式，驗(yàn)證基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)的數(shù)據(jù)是否一致。上調(diào)的基因中：在12 h時2-6、2-3、8b、10、5、10、32、和3基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)完全一致，在24 h時2-6、2-3、5、10、32、和3基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)一致；在60 h時2-3、10、5、10、32、和3基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)一致。下調(diào)的基因中：在12 h時111、1、12、、1、17、2和7基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)一致，在24和60 h時所選的基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)基本一致。

4 結(jié) 論

本研究選取1株致腦膜炎糞腸球菌，通過構(gòu)建腦組織損傷模型，對腦組織進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織先后出現(xiàn)了腦血管充血、血管周圍的間隙增大、腦組織水腫、微血栓形成及炎性細(xì)胞浸潤。通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選差異基因，GO分析發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因主要富集在對β干擾素的反應(yīng)、細(xì)胞對β干擾素的反應(yīng)、對其他生物的防御反應(yīng)、外在凋亡信號通路、調(diào)節(jié)外在凋亡信號通路、神經(jīng)元凋亡過程等一些對細(xì)菌的防御反應(yīng)和細(xì)胞凋亡途徑中。KEGG分析發(fā)現(xiàn)主要富集在過氧物酶體、NOD樣受體信號通路、氧化磷酸化、PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑、鈣代謝信號傳導(dǎo)途徑等通路上，這些通路多與腦組織損傷及損傷指示有關(guān)。本研究為繼續(xù)探究糞腸球菌引起腦組織損傷機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。