麥金玲 王 辰 徐梁格 黃寶玥 張力圖

(1.廣西醫(yī)科大學(xué) 腫瘤醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究部，南寧 530021；2.廣西壯族自治區(qū)腫瘤分子醫(yī)學(xué)工程研究中心，南寧 530021；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 特種環(huán)境復(fù)合材料國(guó)防科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080)

因具有銳峰發(fā)射、大Stokes位移、低細(xì)胞毒性和高效磁矩等特性，稀土元素?fù)诫s的無機(jī)上轉(zhuǎn)換納米粒子(UCNPs)近年來備受化學(xué)研究人員關(guān)注[1-2]。大量新型激活劑和敏化劑的出現(xiàn)，為UCNPs在熒光顯示、生物體內(nèi)成像標(biāo)定及光熱/光動(dòng)力治療等提供了廣闊的應(yīng)用前景[3]。為了進(jìn)一步提高UCNPs的熒光性能，多種合成工藝用來增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換發(fā)光(UCL)強(qiáng)度和顏色調(diào)變，比如高功率激發(fā)、摻雜劑分布優(yōu)化及惰性層包覆等[4-5]。此外，UCNPs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用時(shí)對(duì)粒徑要求十分嚴(yán)格，超過100 nm的顆粒往往不易被細(xì)胞吞噬，無法實(shí)現(xiàn)相關(guān)檢測(cè)與治療過程。目前，小尺寸UCNPs的制備工藝主要為溶膠-凝膠法、水熱/溶劑熱和高溫溶劑法等[6]。但相關(guān)制備工藝復(fù)雜，設(shè)備環(huán)境要求苛刻(無水、無氧等)，且成本較高，產(chǎn)率較低，不利于體內(nèi)標(biāo)定物的大規(guī)模制備和臨床推廣[7]。

為此，本實(shí)驗(yàn)利用高產(chǎn)率、低成本的共沉淀法代替上述合成方法[8]。利用Yb/Er共摻雜方式合成了尺寸較小的納米Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒，并通過Yb3+摻雜濃度和水浴時(shí)間的調(diào)變，實(shí)現(xiàn)了高強(qiáng)度、長(zhǎng)壽命的紅色熒光主導(dǎo)發(fā)射，并對(duì)比了紅綠雙信道的熒光成像體內(nèi)標(biāo)定效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

主要原料有氧化釔(Y2O3，99.9%)、氧化鉺(Er2O3，99.9%)、氧化鐿(Yb2O3，99.9%)、濃硝酸(HNO3，AR)、尿素(CH4N2O，AR)，滌洗溶劑為無水乙醇(C2H5OH，AR)，超純水通過實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)制得(力康，PWVF型)。

檢測(cè)儀器主要有X射線衍射儀(XRD，Rigaku，Japan，D/max TTR-Ⅲ，Cu-Kα射線，λ=0.15405 nm，掃描速度15°/min，掃描范圍20°～80°)；透射電子顯微鏡(TEM，JEOL，Japan，JEM-3010，加速電壓200 kV)；熒光光譜儀FLS980(Edinburgh，K98D08M-30 W，980 nm照射源，范圍400～800 nm)；小動(dòng)物成像系統(tǒng)(Analytik Jena，UVP iBox Explorer)。

1.2 Yx(OH)y(CO)z：Yb3+，Er3+內(nèi)核的制備

按照摩爾百分比Y∶Yb∶Er=89∶10∶1的比例稱取0.1 mol Y2O3/Yb2O3/Er2O3粉末。將粉末混合后投入燒杯中，加入過量濃HNO3并加熱，使其逐漸溶解制得Y/Yb/Er稀土硝酸鹽溶液。用容量瓶將此溶液配至1 mol/L，并用移液器吸取1 mL注入100 mL燒杯內(nèi)，再依次加入3 g尿素及50 mL超純水，連續(xù)攪拌5 min。隨后，將燒杯置于90 ℃水浴鍋內(nèi)加熱3 h。反應(yīng)液冷卻后經(jīng)離心(1 700 r/min，7 min)處理，輔以超純水和無水乙醇交替滌洗3次，留得前驅(qū)體Yx(OH)y(CO)z：Yb3+，Er3+沉淀備用。

1.3 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的制備

采用梯度摻雜的方式進(jìn)行殼層成分設(shè)計(jì)，并去除Er3+形成發(fā)光惰性層，以減少表面缺陷且提高熒光強(qiáng)度。首先，參照內(nèi)核的元素比例設(shè)計(jì)，按Yb(40%)、Yb(80%)、Yb(160%)、Yb(320%)、Yb(640%)的比例，稱取Y2O3/Yb2O3粉末，并利用前述工藝制得1 mol/L Y/Yb稀土硝酸鹽溶液。隨后，另取250 mL燒杯并注入100 mL蒸餾水，倒入3 g尿素和全部前驅(qū)體Yx(OH)y(CO)z：Yb3+，Er3+沉淀，攪拌5 min。最后，加入1 mL Y/Yb稀土硝酸鹽溶液，補(bǔ)水至200 mL后進(jìn)行水浴加熱(90 ℃，3 h)。產(chǎn)物經(jīng)離心滌洗后得到Y(jié)2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒，60 ℃干燥備用。

此外，將Yb3+濃度固定為80%，用相似步驟再次合成Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒，水浴時(shí)間分別調(diào)整為1、2、4、8、16 h。

1.4 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的性能表征

利用TEM觀察納米顆粒的顯微形貌。利用XRD進(jìn)行樣品的物相分析。利用熒光光譜儀FLS980在980 nm(c.w.連續(xù)波)和脈沖激光激發(fā)下分別測(cè)量納米粒子的UCL光譜和衰減曲線(電流設(shè)置為2.00 mA)。利用小動(dòng)物成像系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行納米顆粒的熒光成像。為了準(zhǔn)確比較各組UCNPs的UCL性能，所有UCNPs均在室溫相同條件下進(jìn)行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+納米核殼顆粒的形貌及物相分析

在共沉淀法制備納米核殼材料時(shí)，水浴時(shí)長(zhǎng)可以影響沉淀析出量且改變殼層厚度，改變核殼材料的光學(xué)性能。圖1為不同水浴時(shí)間下Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的顯微形貌照片及其顆粒尺寸分布，且水浴時(shí)間從a至e逐漸增加。結(jié)合電鏡照片、粒徑分布圖和統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(表1)可知，該顆粒的平均尺寸在25.57～26.24 nm范圍內(nèi)變化，且隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，包覆層厚度和樣品的平均粒徑逐漸增大。在殼層包覆初始階段(2 h內(nèi))，UCNPs的粒徑增長(zhǎng)較為緩慢；4～8 h時(shí)，顆粒尺寸迅速增加；隨后，納米粒子的大小趨于穩(wěn)定，包覆層厚度增加放緩。值得注意的是，在粒徑高速增加的階段，離散度明顯加大，其均一性會(huì)受到影響。而經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間的包覆后(16 h)，其粒徑呈集中分布趨勢(shì)，說明其尺寸穩(wěn)定性最優(yōu)。

圖1 不同水浴時(shí)間下Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的TEM圖及其粒度分布Figure 1 TEM image and size distribution of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles in different water bath time.

表1 不同水浴時(shí)間Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的粒徑平均值Table 1 The average particle size of core-shell Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ particles at different water bath time

通過XRD圖譜(圖2)分析該納米核殼顆粒的物相成分，結(jié)果顯示所有衍射峰的出現(xiàn)位置和相對(duì)強(qiáng)度都與Y2O3標(biāo)準(zhǔn)峰匹配，說明該UCNPs顆粒的基質(zhì)相為Y2O3。圖譜中衍射峰為銳峰，且無明顯雜峰，印證了該工藝下納米顆粒結(jié)晶完好，無其它副產(chǎn)物，這有效地保障了UCNPs的熒光發(fā)射能力。

圖2 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的XRD圖Figure 2 XRD pattern of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles.

2.2 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+納米核殼顆粒的UCL光譜分析

為了探究成分與合成工藝對(duì)UNCPs熒光性能的影響，分別選擇Yb3+濃度和水浴時(shí)間作為調(diào)變因素，對(duì)其熒光性能影響進(jìn)行深入分析。由圖3可知，在室溫980 nm連續(xù)波激光條件下，該UCNPs在661 nm波長(zhǎng)附近出現(xiàn)窄帶紅光發(fā)射，對(duì)應(yīng)發(fā)光中心Er3+的4F9/2→4I15/2躍遷。其他條件不變，當(dāng)Yb3+濃度從40%倍數(shù)增加至640%時(shí)，其熒光發(fā)射強(qiáng)度呈先增加后減少的趨勢(shì)，且80%時(shí)發(fā)光強(qiáng)度最高(如圖3a所示)。由此可見，過高和過低的敏化劑濃度均會(huì)嚴(yán)重影響發(fā)光效果。低濃度敏化劑不能充分傳遞光子，而濃度過高則會(huì)形成濃度淬滅[9]。在此基礎(chǔ)上，確定Yb3+濃度為80%，將水浴時(shí)間從1 h增加至16 h，可以發(fā)現(xiàn)2 h內(nèi)其發(fā)光強(qiáng)度變化不大，隨后出現(xiàn)明顯上升和下降，且經(jīng)8 h水浴的UCNPs獲得最高熒光強(qiáng)度(如圖3b所示)。結(jié)合圖1顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果，說明水浴時(shí)間的適當(dāng)延長(zhǎng)、惰性層厚度在合理范圍內(nèi)的增加，有利于改善表面缺陷，使發(fā)光強(qiáng)度逐漸提高。但是，過厚的惰性層會(huì)影響敏化劑光子傳遞效率，導(dǎo)致熒光發(fā)射強(qiáng)度降低。

圖3 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的UCL發(fā)射光譜圖：(a) 不同Yb3+離子濃度；(b) 不同水浴時(shí)間Figure 3 UCL emission spectra of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles：(a) Different concentration of Yb3+ ion；(b) Different bath time.

此外，根據(jù)熒光發(fā)射光譜結(jié)果，進(jìn)一步計(jì)算了Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒熒光發(fā)射的紅綠比(如圖4所示)。所有試樣的紅綠比均大于1，因此可知該UCNPs為紅光發(fā)射主導(dǎo)。但過高和過低的紅綠比會(huì)影響生物成像識(shí)別與標(biāo)記，居中的紅綠比效果較為理想，更適合用作體內(nèi)標(biāo)定及成像研究[10]。

圖4 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的紅綠比：(a) 不同Yb3+離子濃度；(b) 不同水浴時(shí)間Figure 4 The red/green ratio of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles：(a) Different concentration of Yb3+ ion；(b) Different bath time.

2.3 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的UCL壽命分析

在微秒級(jí)范圍內(nèi)，熒光壽命的增加有利于提升熒光標(biāo)記物在生物體內(nèi)的檢測(cè)精度，并降低操作難度。為此，在611 nm紅光處測(cè)試了Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的熒光衰變曲線，并計(jì)算了相關(guān)參數(shù)(如圖5，表2，表3所示)。當(dāng)Yb3+濃度逐漸增加時(shí)，熒光壽命先增加后減小，且160%Yb試樣的壽命最長(zhǎng)(56 μs)，40%Yb試樣的壽命最短(37 μs)。雖然長(zhǎng)壽命有利于熒光成像及標(biāo)定，但是過高的稀土離子濃度，可能對(duì)生物體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)代謝具有不確定性影響。因此，在80%Yb試樣和160%Yb試樣有相近熒光壽命的情況下，更傾向選擇低濃度試樣作為標(biāo)定物。在不同水浴時(shí)間試樣的熒光壽命對(duì)比中，經(jīng)8 h水浴UCNPs的壽命最長(zhǎng)，且與高濃度Yb3+試樣相仿。這說明80%Yb試樣可以通過恰當(dāng)?shù)陌补に?，有效延長(zhǎng)熒光衰減壽命，更適合小動(dòng)物體內(nèi)成像及標(biāo)定過程使用。

圖5 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的壽命曲線：(a) 不同Yb3+離子濃度；(b) 不同水浴時(shí)間Figure 5 Decay curves of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles：(a) Different concentration of Yb3+ ion；(b) Different bath time.

表2 不同Yb3+濃度的UCL壽命曲線擬合結(jié)果Table 2 The results of UCL lifetime curve fitting with different Yb3+ concentrations

表3 不同水浴時(shí)間的UCL壽命曲線擬合結(jié)果Table 3 The results of UCL lifetime curve fitting with different water bath time

2.4 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+納米核殼顆粒的生物體內(nèi)標(biāo)定

選取代表性試樣(80%Yb，8 h水浴)進(jìn)行小動(dòng)物成像，并對(duì)體內(nèi)特征點(diǎn)位進(jìn)行標(biāo)定(如圖6)。首先，在980 nm激光輻照下，注射有代表性試樣的小鼠，其體內(nèi)熒光圖像的強(qiáng)度分布明顯不同(如圖6a所示)。分別利用綠色(圖6b)和紅色(圖6c)通道進(jìn)行信號(hào)采集，并做熱圖分析可知，試樣主要集中在小鼠的主要臟器及尾靜脈注射部位。通過對(duì)比圖6b和6c能夠發(fā)現(xiàn)，紅色通道的信號(hào)強(qiáng)度(I0=771.92 cps)及對(duì)比度明顯比綠色通道的(I0=216.83 cps)要高，這是由于注射的UCNPs試樣紅綠比較高造成的。此外，對(duì)小鼠肺部進(jìn)行點(diǎn)位標(biāo)定處進(jìn)行定量分析，相同位置紅色信道的強(qiáng)度值顯著高于綠色信道(如圖6b和6c黑色十字交點(diǎn)位置)。由此可知，該試樣更適合紅色通道進(jìn)行信號(hào)采集。

圖6 Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+核殼顆粒的小動(dòng)物成像圖：(a) 原始熒光；(b) 綠光分布熱圖；(c) 紅光分布熱圖Figure 6 Animal images of Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+ core-shell particles：(a) Original fluorescence；(b) Heat map of green light；(c) Heat map of red light.

3 結(jié)論

1)包覆層厚度和樣品的平均粒徑會(huì)隨著水浴時(shí)間的增加而逐漸增大，變化范圍在25.57～26.24 nm。

2)經(jīng)8 h水浴的80% Yb摻雜Y2O3UCNPs熒光發(fā)射強(qiáng)度最高，且紅綠比居中，熒光壽命較長(zhǎng)，有利于作為小動(dòng)物體內(nèi)成像及標(biāo)定物。

3)Y2O3：Yb3+，Er3+@Y2O3：Yb3+UCNPs試樣更適用于紅色信道檢測(cè)，熒光強(qiáng)度值更高。