位文濤 李振峰 李林澤 蘇 睿 李曉冬陳永起 VIJAYA Raghavan 胡建東，5*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 機(jī)電工程學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)激光技術(shù)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；3.河南問道光電科技有限公司，鄭州 450002；4.McGill大學(xué) 生物資源工程系，加拿大 蒙特利爾 H9X 3V9；5.小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

2020年《第二次全國污染源普查公報》中水體污染源分布數(shù)據(jù)表明，農(nóng)業(yè)面源總氮(TN)和總磷(TP)污染占地表水體污染總負(fù)荷36.79%和50.23%，盡管較第一次全國污染源普查公報中總氮和總磷排放負(fù)荷57.2%和67.4%有所下降，但農(nóng)業(yè)面源污染仍然是當(dāng)前地表水體污染主要來源。河南省水體污染農(nóng)業(yè)源分布狀況與全國占比基本一致，第二次河南水體污染物普查數(shù)據(jù)表明，河南總氮排放17.4萬t，占總負(fù)荷44.96%，總磷排放為1.8萬t，占總負(fù)荷31.41%。農(nóng)業(yè)面源污染問題已經(jīng)對現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和社會經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1]。

實(shí)驗(yàn)室常規(guī)紫外可見分光光度法土壤有效態(tài)氮磷測定涉及復(fù)雜的前處理和測定過程，不適合現(xiàn)場土壤有效態(tài)氮磷的測試。在現(xiàn)場測試方法中，近紅外光譜[2]、激光誘導(dǎo)擊穿光譜[3-4]和電化學(xué)傳感器[5]等用于土壤有效態(tài)氮磷測試的研究報道很多，但上述測定方法需要建立復(fù)雜的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型，通過復(fù)雜的計(jì)算才能獲得結(jié)果，而且這些測試方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)紫外可見分光光度法的測試結(jié)果差距明顯，必須通過復(fù)雜的校正才能夠被使用，在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中，這些測試結(jié)果的差異導(dǎo)致在精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)和農(nóng)業(yè)面源污染防治應(yīng)用中無法有效銜接原來實(shí)驗(yàn)室測試數(shù)據(jù)。為了提高土壤有效態(tài)氮磷分析效率，科學(xué)家們紛紛研究流動分析方法，并將流動分析方法應(yīng)用于土壤有效態(tài)氮磷測試。根據(jù)流動分析方法原理可分類為擴(kuò)散對流和強(qiáng)迫對流流動分析方法，按具體的實(shí)現(xiàn)途徑分為流動注射分析、順序流動分析、多注射泵注射分析、多電磁閥注射分析和多蠕動泵注射分析等[6]。其中，流動注射分析消耗試劑量小，產(chǎn)生廢液量少[7-8]，是應(yīng)用最成功的土壤和環(huán)境中氮磷分析方法。陳德華等[9]用流動注射分析同時完成水中磷酸鹽、硝酸鹽和亞硝酸鹽測量自動化，與國際分光光度分析方法相比，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在0.29%～15.7%，加標(biāo)回收率93.0%～102%，能夠滿足海洋監(jiān)測規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)要求。楊靖民等[10]應(yīng)用間隔流動分析儀實(shí)現(xiàn)了重氮偶合染色方法的土壤硝態(tài)氮測量自動化，能夠有效地提高分析速度，測試土壤中硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮加標(biāo)回收率98.0%～101.8%，檢測限分別為0.2和200 μg/kg。賀舒文等[11]應(yīng)用流動注射分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)了靛酚藍(lán)比色分析方法自動化，實(shí)現(xiàn)了海水中銨氮在線監(jiān)測分析，有效降低了運(yùn)行成本。

流動分析方法測試速度快[12-13]，屬于瞬態(tài)測量，本論文在研究流動分析方法基礎(chǔ)上提出了微流池多光程流動分析方法，實(shí)現(xiàn)樣品從瞬態(tài)測定到穩(wěn)態(tài)測定，并采用該方法研制了土壤有效態(tài)氮磷分析儀。該儀器中專門設(shè)置了化學(xué)反應(yīng)腔，被測樣品和所需要的試劑依次進(jìn)入化學(xué)反應(yīng)腔并分別在不同的反應(yīng)條件下進(jìn)行。采用蠕動泵擾動化學(xué)反應(yīng)腔中的反應(yīng)物，讓反應(yīng)物在流路過程中實(shí)現(xiàn)擾動-擴(kuò)散流動過程。與通常的擴(kuò)散對流和強(qiáng)迫對流不同，反應(yīng)物可以設(shè)定多次擾動，使之發(fā)生完全徹底的化學(xué)反應(yīng)，然后反應(yīng)物進(jìn)入恒溫光電探測單元，確保了測試結(jié)果的靈敏度、檢出限和穩(wěn)定性，最大限度地使測試結(jié)果接近實(shí)驗(yàn)室紫外可見分光光度計(jì)的值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

微流池多光程土壤有效態(tài)氮磷分析儀(河南農(nóng)業(yè)大學(xué))，D-9系列紫外可見分光光度計(jì)(南京菲勒儀器有限公司)，HY-4A調(diào)速多用振蕩器(湖南前沿科技有限公司)，GL124I-1SCN萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

檸檬酸鈉、水楊酸鈉、硝普鈉、氫氧化鈉、二氯異氰脲酸鈉、Brij-35、磷酸、十水二磷酸鈉、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸肼、磺胺、N-1-萘基乙二胺鹽酸、鉬酸銨、酒石酸銻鉀、抗壞血酸、磷酸二氫鉀、濃硫酸、十二烷基硫酸鈉、氯化鈷均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水，GBW(E)083113銨氮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，BWZ6607-2016硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、BW081622-2磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

微流池多光程土壤有效態(tài)氮磷分析儀由定量化取樣單元、微流池多光程反應(yīng)腔、模塊化光電探測單元和自動化清洗系統(tǒng)4個模塊構(gòu)成。微流池多光程流動分析方法原理如圖1所示，采用了兩個多通道電磁閥切換多個土壤氮磷樣品和試劑，高精度注射泵提取土壤氮磷樣品和試劑，取樣環(huán)防止在樣品進(jìn)樣過程中發(fā)生污染。取樣環(huán)和多通道切換閥相連，程序控制樣品和試劑自動進(jìn)入反應(yīng)腔。蠕動泵的正反轉(zhuǎn)擾動反應(yīng)腔中的反應(yīng)物，加速其化學(xué)反應(yīng)發(fā)生過程，提供了近穩(wěn)態(tài)的測量方法。夾管閥控制反應(yīng)樣品前后大氣泡的進(jìn)入時間，而液位傳感器監(jiān)測液體的位置，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)信號采集與處理，所測量結(jié)果直接在顯示屏上顯示。小氣泡把同一個樣品分割成多段進(jìn)行測量，有效地提高了測量準(zhǔn)確性。

圖1 微流池多光程流動分析方法原理示意圖Figure 1 Principle diagram of a measurement system using a micro-tube with a multi-optical length based flow analysis method.

模塊化光電探測單元內(nèi)嵌微流池，光程長可設(shè)定10、20和30 mm三種，滿足了不同靈敏度測試對象需求。三種波長的發(fā)光芯片封裝在一個LED管里，程序控制選擇不同工作波長，用于不同種類物質(zhì)的測定。模塊化光電探測單元采用PIC32MI系列微處器，光電信號通過放大器放大之后轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號并與主控制器通過RS485接口進(jìn)行傳輸。儀器系統(tǒng)內(nèi)部通過RS232接口和RS485協(xié)議對注射泵、蠕動泵和多通道切換閥進(jìn)行管理，使測試數(shù)據(jù)能夠?qū)崟r上傳到信息共享平臺，微流池多光程土壤有效態(tài)氮磷分析儀見圖2。

圖2 微流池多光程土壤有效態(tài)氮磷分析儀Figure 2 Soil available nitrogen and phosphorus analyzer using a Micro-tube with multi-optical length.

1.3 樣品處理與制備

實(shí)驗(yàn)樣品為廣東省韶關(guān)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所現(xiàn)場采取的9個土樣和北京市農(nóng)林科學(xué)院提供的17個土樣，風(fēng)干后各稱取過2 mm篩的土樣5 g(精確至0.001 g)，放入150 mL的三角瓶中，加入50 mL去離子水，轉(zhuǎn)速為180～200 r/min振蕩30 min，然后立即用無磷濾紙過濾，未澄清的溶液用高速離心機(jī)離心過濾或者用濾膜過濾待測液(過濾液應(yīng)該在4 h內(nèi)完成檢測，最長不超過8 h，以免過濾液出現(xiàn)渾濁沉淀)。該待測液用于檢測土壤中有效態(tài)銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷含量。

1.4 實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用

對廣東省韶關(guān)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所(113°45′36″E，24°53′49″N)現(xiàn)場采集9個土壤樣品(編號S1～S9)進(jìn)行處理，對土樣中有效態(tài)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 影響氮磷測定的光源穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

微流池多光程土壤有效態(tài)氮磷測定采用了組合LED芯片，可以程序控制選擇550和660 nm波長，但LED峰值波長隨著工作時間延長或者LED驅(qū)動電流變化，峰值波長發(fā)生紅移。微流池多光程土壤有效態(tài)氮磷測定系統(tǒng)采用了精密場效應(yīng)管的恒流源電路動態(tài)調(diào)整LED驅(qū)動電流，同時交替測量空白和樣品的透射光強(qiáng)，極大地降低了工作時間對LED性能影響，確保了氮磷測定結(jié)果的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)采用10 g/L的硫酸銅溶液和4 g/L的氯化鈷溶液分別測定550和660 nm波長的LED光強(qiáng)，測試時間為30 min，重復(fù)5次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，其中550和660 nm波長LED光強(qiáng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.10%和0.13%。

圖3 組合光源穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Figure 3 Stability of a compact LED light source.

2.2 方法檢出限與線性范圍

測定11次空白溶液的吸光度結(jié)果如表1所示，檢出限(LOD，mg/L)的計(jì)算公式為LOD=3S/b，(S，mg/L為11次測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為接近LOD標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)。通過計(jì)算，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷的檢出限分別為0.008 6、0.009 4和0.007 8 mg/L。

表1 銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷檢出限測定值Table 1 Determination of the detection limit of ammonium nitrogen，nitrate nitrogen and phosphorus

取銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至1、2、3、4 mg/L，根據(jù)銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度和空白溶液吸光度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2分別為0.999 8、0.999 7和0.999 4，如圖4所示。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(a)銨態(tài)氮；(b)硝態(tài)氮；(c)磷Figure 4 Standard curves.(a)Ammonium nitrogen；(b)Nitrate nitrogen；(c)Phosphorus

2.3 樣品測定結(jié)果

在標(biāo)準(zhǔn)曲線建立后，采用微流池多光程土壤有效態(tài)氮磷分析儀對廣東省韶關(guān)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所9個土壤樣品進(jìn)行測定，同時分別通過紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行對比測試。銨態(tài)氮和硝態(tài)氮測定值如表2、3所示，R2分別為0.946 1和0.995 4，如圖5所示。

圖5 韶關(guān)土樣的測定值對比(a)銨態(tài)氮；(b)硝態(tài)氮Figure 5 Comparison of measured values of soil samples from Shaoguan.(a) ammonium nitrogen；(b) nitrate nitrogen

表2 微流池多光程分析儀與紫外可見分光光度計(jì)測定土壤銨態(tài)氮值對比Table 2 Comparison of the measured values of ammonium nitrogen in soil using micro-tube with multi-optical length analyzer and ultraviolet-visible spectrophotometer /(mg·L-1)

表3 微流池多光程分析儀與紫外可見分光光度計(jì)測定土壤硝態(tài)氮值對比Table 3 Comparison of measured values of nitrate nitrogen in soil using micro-tube with multi-optical length analyzer and ultraviolet-visible spectrophotometer /(mg·L-1)

北京市農(nóng)林科學(xué)院提供的17個測試土樣(均通過紫外可見分光光度計(jì)測試)，8個硝態(tài)氮測試土樣(編號B 1～8)和9個磷測試土樣(編號B 9～17)通過微流池多光程土壤有效態(tài)氮磷分析儀進(jìn)行分析對比，土壤樣品中硝態(tài)氮和磷測定值如表4、5所示，R2分別為0.980 1和0.888 9，如圖6所示。

表4 用微流池多光程分析儀和紫外可見分光光度計(jì)的測定土樣中硝態(tài)氮值Table 4 Measured values of nitrate nitrogen in soil samples using micro-tube with multi-optical length analyzer and ultraviolet-visible spectrophotometer /(mg·L-1)

表5 土樣中磷用微流池多光程分析儀和紫外可見分光光度計(jì)的測定值Table 5 Measured values of phosphorus in soil samples using micro-tube with multi-optical length analyzer and ultraviolet-visible spectrophotometer /(mg·L-1)

圖6 土樣測定值對比(a)硝態(tài)氮；(b)磷Figure 6 Comparison of measured values of soil samples.(a)Nitrate nitrogen；(b)Phosphorus

2.4 方法精密度與準(zhǔn)確度

微流池多光程土壤有效態(tài)氮磷分析儀在進(jìn)行銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷重復(fù)性測定值如表6所示。在樣品中加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果見表7。結(jié)果表明，本方法測試銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=7)分別為0.80%、5.7%和0.90%，加標(biāo)回收率在92.0%～103%，滿足現(xiàn)場測試要求。

表6 銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷重復(fù)性測定值Table 6 Repeatability of ammonium nitrogen，nitrate nitrogen and phosphorus /(mg·L-1)

表7 微流池多光程流動分析方法加標(biāo)回收率Table 7 Spiked recoveries of micro-tube with multi-optical length flow analysis method

3 結(jié)論

分析了微流池多光程流動分析方法的組成結(jié)構(gòu)，并測定了土壤中的有效態(tài)氮和磷，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷的檢出限分別為0.008 6、0.009 4和0.007 8 mg/L。測試了廣東省韶關(guān)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所現(xiàn)場采取的土樣和北京市農(nóng)林科學(xué)院提供的土樣，并與紫外可見分光光度計(jì)的測定結(jié)果對比分析，結(jié)果表明本方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.80%、5.7%和0.90%，加標(biāo)回收率在92.0%～103%，單樣品平均測試時間6 min。采用微流池多光程流動分析方法檢測土壤中的有效態(tài)氮磷，本方法具有誤差較小，檢出限低，自動化程度高，試劑用量少等特點(diǎn)，對大批量樣品的檢測具有不可比擬的優(yōu)勢。