榮華 孫曉雪 李曉明 徐天嬌 李旭 郭科東

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）作為一種神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)生于60 歲以上的老年人群，常伴有靜止性震顫、肌肉僵直、運(yùn)動緩慢以及步態(tài)異常等臨床癥狀，中腦黑質(zhì)致密部多巴胺（DA）能神經(jīng)元的丟失以及路易小體的形成是該疾病的典型病理特征[1，2]。α-突觸核蛋白（α-syn）為路易小體主要成分，與PD 的發(fā)生與發(fā)展存在密切聯(lián)系，其含量過度升高會引發(fā)神經(jīng)元死亡，因此，抑制α-syn的表達(dá)將成為治療PD 的研究方向[3，4]。

目前西醫(yī)尚無根治PD 的有效方法，循證醫(yī)學(xué)推薦的左旋多巴、多巴胺受體激動劑和單胺氧化酶B（Monoamine oxidase B，MAO-B）抑制劑長期使用會誘發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)且會出現(xiàn)療效衰退的現(xiàn)象。中藥類制劑可明顯改善PD 患者運(yùn)動癥狀，并緩解其他非運(yùn)動癥狀，因此中藥及其活性單體成分受到廣泛關(guān)注。研究證實(shí)芍藥苷可以透過血腦屏障，具有神經(jīng)保護(hù)的作用，且發(fā)現(xiàn)芍藥苷的作用機(jī)制可能與促進(jìn)神經(jīng)生長、抗神經(jīng)細(xì)胞氧化、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等有關(guān)[5]。因此，本研究采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）作為誘導(dǎo)劑致使模型小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生損傷，觀察芍藥苷對神經(jīng)元的保護(hù)作用，并對相應(yīng)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級C57BL/6 小鼠，雄性3月齡，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物許可證號：SCXK（遼）2020-0001，體質(zhì)量20～25g。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過我院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：QMUAECC-2021-127。

1.2 藥品與試劑 藥品包括芍藥苷（瑞芬思生物科技有限公司）、MPTP（美國Sigma 公司），試劑包括α-syn 抗體（英國abcam 公司）、TH 抗體（博士德生物有限公司），TRIzol Reagent（美國Gibcobrl 公司）、SYBR Green I master mix（美國ABI 公司），引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 儀器 Stratagene 實(shí)時熒光定量PCR 儀（Agilent公司，型號：Mx2005P），全自動酶標(biāo)儀（BioTek 公司，型號：S1000），Iamge Analysis System（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，型號：Smart Chemi）。YABO 電腦自動脫水機(jī)及YABO0400 組織包埋機(jī)[常州雅博電子設(shè)備有限公司、RM2233Leica 切片機(jī)德國（3B）]、PURELAB PLUS 超純水機(jī)（美國波爾公司）、Thermo超低溫冰箱88000（Thermo 公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物分組 小鼠在25℃，濕度40%環(huán)境下自由攝食飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。隨機(jī)將受試小鼠分為對照組、模型組、司來吉蘭組、芍藥苷低劑量組、芍藥苷高劑量組，每組10 只小鼠。除對照組外其余各組均給予MPTP（25mg/kg）腹腔注射7d，同時在注射給藥1h 后給予藥物灌胃治療，司來吉蘭組小鼠采用10mg/kg 司來吉蘭灌胃治療，芍藥苷低劑量組小鼠以7.5mg/kg 芍藥苷灌胃，芍藥苷高劑量組小鼠以30mg/kg 芍藥苷灌胃，治療14d。灌胃給藥結(jié)束后進(jìn)行爬桿與轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)，對小鼠行為學(xué)進(jìn)行檢測后，小鼠取腦，冰上快速剝離黑質(zhì)備用。

1.4.2 行為學(xué)檢測

1.4.2.1 爬桿實(shí)驗(yàn) 將長度為50cm，直徑為1cm 的金屬桿頂部固定直徑為2.5cm 的圓球，為防止打滑，使用紗布包繞桿部，將小鼠置于球上，以小鼠雙前肢接觸桿底平臺認(rèn)定為爬完全程，記錄小鼠爬桿時間，每30min 進(jìn)行1 次測量，共3 次，取平均值。

1.4.2.2 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 在正式測試前先對小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，以轉(zhuǎn)速15r/min，訓(xùn)練時間為120s，連續(xù)3d。檢測時轉(zhuǎn)棒儀起始轉(zhuǎn)速為4r/min，最大為40r/min，加速度為20r/min，測試時間5min，記錄小鼠從轉(zhuǎn)棒開始到掉下轉(zhuǎn)棒的時間（運(yùn)動潛伏時間）。進(jìn)行3 次測試，每次間隔30min，取平均值。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測 采用AnnexinV-FITC 雙染法測定細(xì)胞凋亡率。取小鼠黑質(zhì)區(qū)組織，加入4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液PBS 制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至約1×106個/ml。反應(yīng)管中加400μlPBS，流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4.4 caspase-3 活性檢測 制備腦組織勻漿液，按照試劑盒操作方法檢測各組小鼠腦組織裂解液中caspase-3 活性。

1.4.5 透射電子顯微鏡下觀察小鼠神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)改變 冰上迅速取小鼠黑質(zhì)組織約1mm3，置于2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜，酒精丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙酮+環(huán)氧樹脂（1:1）浸透，環(huán)氧樹脂包埋、固化，制備半薄切片和超薄切片，進(jìn)行雙重染色（醋酸鈾-檸檬酸鉛），電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.6 免疫組織化學(xué)法檢測TH 陽性神經(jīng)元平均光密度 4%多聚甲醛固定腦組織，4℃保存72h 后，脫水浸蠟后進(jìn)行包埋。中腦黑質(zhì)區(qū)域冠狀切片，65℃烘片6h，進(jìn)行脫蠟、水化處理后，開始TH 免疫組織化學(xué)染色。

1.4.7 免疫印跡檢測α-syn 蛋白的表達(dá) 快速取腦，加入200μl 包含蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑的裂解液，10 000r/min，4℃離心10min，微孔板法進(jìn)行蛋白濃度的測定，酶標(biāo)儀上562nm 波長處檢測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的蛋白濃度。SDS 凝膠電泳分離蛋白，電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，4℃封閉過夜。加入一抗α-syn（1:1000），加入二抗室溫孵育2h，TBST 溶液洗膜3 次，每次10min。暗室進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影及定影。AlphaEaseFC 圖像分析軟件進(jìn)行分析，以GAPDH 條帶作為內(nèi)參，計算公式：相應(yīng)蛋白表達(dá)量=相應(yīng)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4.8 實(shí)時定量PCR 檢測α-syn mRNA 表達(dá) 取60mg 腦組織，加入600μl Trizol 溶液，使用電動組織研磨器將腦組織在冰上進(jìn)行勻漿處理提取黑質(zhì)總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增PCR。α-syn 引物序列：F 5'-TGGCTTTGTCAAGAAGGACC AGATG-3'，R 5'-CCACAGGCATGTCTTCCAGGATTC-3'。擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用SNK 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芍藥苷對PD 小鼠行為學(xué)的影響 與對照組比較，模型組小鼠爬桿時間顯著延長，在棒停留時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組爬桿時間均縮短（P＜0.05），且高劑量組小鼠爬桿時間較低劑量組更短，在棒時間增多，與司來吉蘭組比較，芍藥苷各劑量組爬桿時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠爬桿時間和在棒停留時間的比較（±s，s）

表1 各組小鼠爬桿時間和在棒停留時間的比較（±s，s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 n 爬桿時間 在棒時間對照組 10 7.11±0.16 234.07±17.54模型組 10 17.17±1.67a 109.80±9.91a司來吉蘭組 10 12.30±0.17b 172.41±11.58b芍藥苷低劑量組 10 13.52±0.55b 123.64±9.96b芍藥苷高劑量組 10 12.85±0.54b 165.00±6.59b

2.2 芍藥苷對PD 小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡及caspase-3活性的影響 與對照組比較，模型組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡率及caspase-3 活性水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞凋亡率及caspase-3 活性水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且芍藥苷高劑量組的效果最為明顯，與司來吉蘭組效果相似。見表2。

表2 各組小鼠細(xì)胞凋亡率及caspase-3 活性表達(dá)的比較（x—±s）

2.3 芍藥苷對PD 小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響 對照組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞器清晰，核膜完整，細(xì)胞質(zhì)豐富，線粒體嵴清晰。與對照組比較，模型組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，異染色質(zhì)邊集，核周隙增寬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體變性，有明顯脂褐素沉著；與模型組比較，司來吉蘭組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)較完好，偶見脂褐素沉著；芍藥苷低、高劑量組小鼠神經(jīng)元核固縮減輕，脂褐素減少，且芍藥苷高劑量組效果更為明顯，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)。見圖1。

圖1 各組小鼠細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)（TEM，×13000）

2.4 芍藥苷對PD 小鼠TH 免疫組化結(jié)果的影響與對照組比較，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)域TH 平均光密度值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組均可不同程度的增加TH 的表達(dá)，芍藥苷高劑量組效果更為顯著，與司來吉蘭組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠黑質(zhì)TH 平均光密度值比較（±s）

表3 各組小鼠黑質(zhì)TH 平均光密度值比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 n TH（MOD）對照組 10 0.61±0.04模型組 10 0.19±0.01a司來吉蘭組 10 0.48±0.02b芍藥苷低劑量組 10 0.26±0.06芍藥苷高劑量組 10 0.44±0.02b

2.5 芍藥苷對PD 小鼠α-syn 蛋白及mRNA 表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組小鼠腦組織α-syn 蛋白及mRNA 水平明顯升高；與模型組比較，司來吉蘭組、芍藥苷高劑量組均能下調(diào)其表達(dá)水平（P＜0.05），芍藥苷低劑量組作用不明顯，芍藥苷高劑量組效果較好，與司來吉蘭相比無顯著差異（P＞0.05）。見表4。

表4 各組小鼠α-syn 蛋白及mRNA 水平比較（±s）

表4 各組小鼠α-syn 蛋白及mRNA 水平比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 n α-syn 蛋白（%） α-syn mRNA對照組 10 100.00±0.00 1.01±0.12模型組 10 166.32±15.68a 1.49±0.17a司來吉蘭組 10 130.25±13.16b 1.20±0.06b芍藥苷低劑量組 10 155.64±20.14 1.38±0.20芍藥苷高劑量組 10 128.16±19.27b 1.22±0.11b

3 討論

據(jù)流行病學(xué)顯示，PD 已成為繼阿爾茨海默病后影響老年人群身心健康的第二大神經(jīng)退行性疾病，且人口老齡化是當(dāng)今世界發(fā)展的必然趨勢[6]。DA 能神經(jīng)元的顯著缺失以及細(xì)胞中路易小體的形成，是疾病的主要病理特征[7，8]。在臨床中DA 類藥物的替代治療是常用的手段，并且從神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究PD 的發(fā)病原因越來越受到重視[9，10]。MPTP是廣泛用于小鼠PD 誘導(dǎo)模型的金標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)毒素，它通過凋亡通路選擇性地引起黑質(zhì)和紋狀體DA 能神經(jīng)元的死亡[11]，能夠成功在小鼠身上再現(xiàn)PD 患者的軀體癥狀，是理想的動物模型[12，13]。

芍藥苷是中藥白芍中分離得到的一種單萜苷，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有廣泛的藥理作用，被用于治療腦缺血[14]及神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病[15]和帕金森病[16]。芍藥苷具有改善學(xué)習(xí)記憶、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗氧化等作用[17，18]。已有研究表明芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)作用是通過激活腺苷A1 受體、改善膽堿能神經(jīng)功能、調(diào)節(jié)離子通道穩(wěn)態(tài)、延緩神經(jīng)元氧化應(yīng)激和凋亡、促進(jìn)神經(jīng)生長、提供神經(jīng)保護(hù)等途徑實(shí)現(xiàn)的[19～22]。但芍藥苷對神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制尚不十分明確。以往的試驗(yàn)研究是進(jìn)行預(yù)防性給予藥物治療后再進(jìn)行造模誘導(dǎo)，為了更貼近于臨床實(shí)際情況，在此次研究中我們采用MPTP 腹腔注射給藥受試小鼠，同時進(jìn)行芍藥苷治療性給藥，發(fā)現(xiàn)芍藥苷低、高劑量組小鼠的黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象有所改善，提示芍藥苷通過抑制MPTP 誘導(dǎo)的黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡發(fā)揮治療作用。

TH 作為檢測DA 能神經(jīng)元的金標(biāo)準(zhǔn)[23]，它可以反映出神經(jīng)元的位置和數(shù)量，用來判斷MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型的嚴(yán)重程度[24]。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者和凋亡級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵要素。有學(xué)者提出PD 患者死亡后腦內(nèi)的caspase-3 陽性神經(jīng)元數(shù)量呈增加的趨勢，說明其是人類及動物患PD 時神經(jīng)元凋亡的易感因子和最終效應(yīng)器[25]。α-syn作為路易小體的主要成分之一，其表達(dá)水平能夠反映出PD 病理機(jī)制的關(guān)鍵[26]。本次研究結(jié)果顯示芍藥苷可以減輕MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠的異常行為,提高運(yùn)動能力，改善腦部細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，減輕黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷，抑制caspase-3 的活化水平，降低PD小鼠腦組織α-syn 高表達(dá)。由此初步推測芍藥苷具有神經(jīng)保護(hù)作用，提示芍藥苷可能通過調(diào)節(jié)控制α-syn 分子水平來發(fā)揮效應(yīng)。