何維敏，況世昌，李筱雯，王純，崔衛(wèi)濤，王喜亮，肖運(yùn)才，李自力，周祖濤

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖北華大瑞爾科技有限公司/生物發(fā)酵制劑湖北省工程研究中心，武漢 430070）

腸道具有皺襞、絨毛和微絨毛等結(jié)構(gòu)，是動(dòng)物機(jī)體重要的功能性器官，除具有消化食物、吸收營(yíng)養(yǎng)的功能，還具有防止外界病原、毒素等有害物質(zhì)侵入的腸屏障功能［1］。腸道主要通過(guò)3個(gè)屏障來(lái)保護(hù)機(jī)體免受病原的感染，分別是黏膜屏障、微生物屏障和免疫屏障［2］。腸黏膜屏障又由腸黏膜上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接和菌膜構(gòu)成［3］。腸道菌群對(duì)腸道屏障有較大影響，腸道菌群加速腸上皮細(xì)胞更新，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)；與腸上皮細(xì)胞相互作用促進(jìn)上皮細(xì)胞合成和分泌抗菌肽［4］；參與調(diào)節(jié)分泌腸道免疫活性因子抵御致病菌［5］。仔豬自然斷奶時(shí)間為17周齡，集約化養(yǎng)殖將仔豬斷奶時(shí)間提前至3～4周齡。當(dāng)斷奶發(fā)生時(shí)，仔豬飼喂環(huán)境發(fā)生巨大變化，出現(xiàn)食欲下降、生長(zhǎng)減緩、免疫力下降、腹瀉甚至死亡，上述變化稱為早期斷奶綜合征即斷奶應(yīng)激。斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬的影響主要集中于腸道，主要表現(xiàn)為對(duì)腸道結(jié)構(gòu)、腸道微生物和腸道免疫的影響［4］。研究表明，在仔豬飲水中加入復(fù)方中藥制劑能夠改善仔豬的生長(zhǎng)性能，提高仔豬免疫力，緩解斷奶應(yīng)激癥狀［6］。微生態(tài)制劑具有黏附作用和競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，與病原菌搶占腸道黏膜的結(jié)合位點(diǎn)，抑制其繁殖，發(fā)揮屏障功能［7］。

本試驗(yàn)將發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑（組方：白術(shù)、白芍、黨參、茯苓）和微生態(tài)制劑聯(lián)合添加在斷奶仔豬日糧中，測(cè)定仔豬腸道結(jié)構(gòu)、腸組織基因表達(dá)和腸道菌群變化，為微生態(tài)制劑在緩解仔豬斷奶應(yīng)激中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑：經(jīng)薄層色譜鑒定合格的發(fā)酵中藥合劑，主要成分：白術(shù)、白芍、黨參、茯苓，由湖北華大瑞爾科技有限公司提供。

微生態(tài)制劑：枯草芽孢桿菌TL，有效活菌數(shù)2.0×1011CFU/g，由湖北華大瑞爾科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取23日齡斷奶、平均體重為（7.744±0.446）kg的杜長(zhǎng)大三元雜交健康仔豬120頭，隨機(jī)分為4個(gè)組：對(duì)照組（基礎(chǔ)日糧）、抗生素組（基礎(chǔ)日糧+0.075 g/kg金霉素+0.015 g/kg恩拉霉素+0.1 g/kg喹乙醇）、試驗(yàn)Ⅰ組（基礎(chǔ)日糧+0.3%發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑+0.15 g/kg枯草芽孢桿菌TL）、試驗(yàn)Ⅱ組（基礎(chǔ)日糧+0.3%發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑+0.3 g/kg枯草芽孢桿菌TL），每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10頭仔豬。飼喂時(shí)間為仔豬保育階段，具體從23日齡開始到52日齡結(jié)束，共30 d。

1.3 試驗(yàn)日糧

仔豬前期乳豬料和后期仔豬料由湖北加益加生物科技有限公司提供，其乳豬料為粉料，仔豬料為顆粒料。每天飼喂前將抗生素、發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑和微生物制劑分別與基礎(chǔ)日糧充分混合后投入使用，保證現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于3—4月進(jìn)行。在仔豬斷奶后第1周飼喂乳豬料，斷奶后第8～11天將乳豬料和仔豬料分別按照4∶1、3∶2、2∶3、1∶4的比例進(jìn)行混合飼喂，逐步將乳豬料過(guò)渡到仔豬料。每天飼喂仔豬4次，時(shí)間分別是8：00、12：00、16：00和20：00，計(jì)量不限料（以料槽無(wú)剩余料為原則）并按欄記錄飼料投喂量；采用鴨嘴式自動(dòng)飲水器，自由飲水。期間免疫接種程序按規(guī)模化豬場(chǎng)養(yǎng)殖程序進(jìn)行。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的測(cè)定試驗(yàn)結(jié)束后，各組分別選取3只仔豬，屠宰，從十二指腸、空腸和回腸中段小心切取約2 cm長(zhǎng)的組織樣品，石蠟包埋切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色封片，使用日本Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡并結(jié)合NIS-Elements高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察、取圖和拍照，測(cè)定10根完整絨毛髙度（VH）和隱窩深度（CD），并計(jì)算絨毛高度與隱窩深度的比值（VH/CD）。

1.5.2 腸組織基因表達(dá)水平的測(cè)定分別提取十二指腸和空腸組織RNA，以組織中β-actin為內(nèi)參基因，RT-PCR檢測(cè)十二指腸和空腸中黏蛋白MUC2、緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的mRNA表達(dá)水平，PCR引物如表1所示。

表1 基因PCR引物

1.5.3 腸道菌群的測(cè)定各組分別選取3只仔豬，分別取盲腸內(nèi)容物，使用Aidlab糞便基因組DNA快速提取試劑盒提取盲腸內(nèi)容物DNA。qRT-PCR法檢測(cè)盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌和乳酸桿菌含量，方法參考Chiang等［11］和Walter等［12］。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算定量結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007軟件初步處理，再用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)方差同質(zhì)性和正態(tài)性檢驗(yàn)，滿足條件后進(jìn)行方差分析。利用ONE-WAY ANOVA、LSD進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，在差異顯著基礎(chǔ)上用Ducan法做多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）”形式表示，P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，與對(duì)照組、抗生素組和試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅰ組的十二指腸VH/CD值分別提高32.27%、4.26%和8.60%，差異極顯著（P＜0.01）。

表2 發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響

空腸腸道形態(tài)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，抗生素組、試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組腸絨毛高度分別提高了20.23%（P＜0.01）、24.23%（P＜0.01）和12.43%（P＜0.01），其隱窩深度則分別降低了6.23%（P＜0.01）、9.49%（P＜0.01）和11.69%（P＜0.01），VH/CD值分別提高了28.23%（P＜0.01）、37.23%（P＜0.01）和27.31%（P＜0.01）。試驗(yàn)Ⅰ組VH/CD值比抗生素組提高了7.02%（P＜0.01）。

回腸腸道形態(tài)結(jié)果表明，與對(duì)照組和抗生素相比，試驗(yàn)Ⅰ組VH/CD值分別提高了56.44%（P＜0.01）和43.83%（P＜0.01），試驗(yàn)Ⅱ組VH/CD值則分別提高了36.89%（P＜0.01）和25.86%（P＜0.01）。試驗(yàn)Ⅰ組與試驗(yàn)Ⅱ組比，VH/CD值提高14.28%（P＜0.01）。

2.2 發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道基因表達(dá)量的影響

發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道基因表達(dá)量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。由圖1可知，與對(duì)照組相比，抗生素組和試驗(yàn)Ⅰ組MUC2基因mRNA表達(dá)上調(diào)，試驗(yàn)Ⅱ組下調(diào)（P＞0.05）?？股亟M和試驗(yàn)Ⅰ組差異不顯著（P＞0.05），與試驗(yàn)Ⅱ組差異顯著（P＜0.05），試驗(yàn)Ⅰ組效果優(yōu)于試驗(yàn)Ⅱ組。

圖1 腸道黏蛋白MUC2基因表達(dá)量

由圖2可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅰ組和試驗(yàn)Ⅱ組十二指腸胞質(zhì)蛋白ZO-1基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)（P＞0.05），但跨膜蛋白Occludin基因mRNA表達(dá)水平都下調(diào)（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅱ組空腸胞質(zhì)蛋白ZO-1基因表達(dá)上調(diào)（P＞0.05），試驗(yàn)Ⅰ組空腸跨膜蛋白Occludin基因表達(dá)上調(diào)（P＞0.05），試驗(yàn)Ⅱ組Occludin基因表達(dá)下調(diào)（P＞0.05）。

圖2 小腸緊密連接蛋白ZO-1基因和Occludin基因mRNA表達(dá)量

2.3 發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響

大腸桿菌、乳酸桿菌qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。大腸桿菌K88標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-5.101 0x+55.960，R2為0.998 0；乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.841 1x+46.305，R2為0.997 8，符合試驗(yàn)要求，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建成功。

圖3 大腸桿菌K88和乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線

發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，抗生素組和試驗(yàn)Ⅰ組中大腸桿菌數(shù)量較低，但與對(duì)照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)Ⅰ組乳酸桿菌數(shù)量均提高，較對(duì)照組和抗生素組提高21.22%（P＜0.05）和33.70%（P＜0.01），試驗(yàn)Ⅱ組乳酸桿菌數(shù)量高于抗生素組（P＜0.05），但與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響

3 討論

3.1 發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道結(jié)構(gòu)的影響

小腸是機(jī)體消化和吸收的主要部位，腸壁形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性是影響腸道健康和機(jī)體消化吸收的關(guān)鍵。腸道功能與絨毛高度和隱窩深度密切相關(guān)。小腸絨毛是腸上皮和固有層向腸腔內(nèi)突而成，與小腸柱狀細(xì)胞表面的微絨毛，擴(kuò)大了黏膜表面積，增加了小腸與養(yǎng)分之間的接觸面積，能有效促進(jìn)養(yǎng)分的消化和吸收，故絨毛長(zhǎng)度增長(zhǎng)，表示腸道營(yíng)養(yǎng)吸收功能也會(huì)提高。腸隱窩又稱小腸腺，是相鄰絨毛根部的上皮向固有層內(nèi)凹所形成的管狀腺體，在隱窩中下部的干細(xì)胞能不斷分裂增殖，產(chǎn)生的子細(xì)胞向上遷移至絨毛頂端，并分化成熟來(lái)補(bǔ)充絨毛上皮頂端凋亡脫落的吸收細(xì)胞和杯狀細(xì)胞［13］。隱窩變淺表示細(xì)胞凋亡速度減緩，腸上皮細(xì)胞成熟率上升，絨毛形態(tài)正常。絨毛和隱窩比值反映小腸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收功能的綜合性指標(biāo)，其比值越大，表明小腸的消化吸收功能越強(qiáng)［14］。

劉惠［15］將中草藥復(fù)合粗多糖應(yīng)用于斷奶仔豬后可較大程度提高其小腸絨毛高度和VH/CD值。殷超［16］用由黃芪、黃芩、黃柏、黨參等中藥提取物所組成的中草藥復(fù)方制劑作用于斷奶仔豬后能顯著增加小腸絨毛高度，降低了隱窩深度。仔豬早期斷奶應(yīng)激會(huì)使腸絨毛高度下降、隱窩深度加深。本試驗(yàn)在斷奶仔豬日糧中添加中藥微生態(tài)制劑和抗生素可以提高十二指腸、空腸及回腸的絨毛高度和VH/CD值（P＜0.01），降低了各小腸隱窩深度，且中藥微生態(tài)制劑組效果優(yōu)于抗生素組，表明中藥微生態(tài)制劑在保護(hù)斷奶仔豬小腸的正常結(jié)構(gòu)、促進(jìn)腸道形態(tài)發(fā)育、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收等方面有重要作用。

3.2 發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸組織基因表達(dá)的影響

MUC2是跨膜糖蛋白分子，是黏液細(xì)胞分泌的主要黏蛋白，能形成彈性的膠體狀覆蓋物，保護(hù)黏膜免受物理、化學(xué)、病原微生物等各種有害因素的損傷，并參與細(xì)胞間的黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖和分化，維持細(xì)胞完整性等過(guò)程有顯著影響，是消化道內(nèi)先天性免疫屏障的重要組成部分。緊密連接（TJ）作為細(xì)胞間最重要的連接方式，位于腸上皮細(xì)胞膜外側(cè)的頂部，主要由ZO-1、Occludin、Claudins 3種蛋白構(gòu)成，與腸上皮細(xì)胞共同形成動(dòng)態(tài)的選擇性通透屏障（機(jī)械屏障），在阻止病原體等有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的同時(shí)，允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)，對(duì)維持腸道上皮屏障功能的完整性及腸上皮細(xì)胞的極性和通透性具有重要作用［17，18］。王元心［19］研究發(fā)現(xiàn)益生菌有促進(jìn)黏蛋白MUC2的分泌，升高mRNA表達(dá)水平的作用，有利于增強(qiáng)雛雞黏膜免疫屏障的防御功能。本研究中，與對(duì)照組相比，抗生素組和中藥微生態(tài)制劑Ⅰ組空腸中MUC2基因mRNA表達(dá)水平上調(diào)，中藥微生態(tài)制劑Ⅱ組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明中藥微生態(tài)制劑和抗生素可以增加仔豬腸道MUC2的表達(dá)量，增強(qiáng)腸道的化學(xué)屏障功能。研究表明，緊密連接蛋白質(zhì)的高表達(dá)可維持腸黏膜機(jī)械屏障的完整性，對(duì)維持?jǐn)嗄套胸i腸黏膜通透性和阻止有害物質(zhì)入侵起重要作用［20，21］。

本研究發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)Ⅱ組斷奶仔豬十二指腸和空腸ZO-1基因表達(dá)上調(diào)（P＞0.05），Occludin基因表達(dá)略下調(diào)（P＞0.05）；中藥微生態(tài)制劑Ⅰ組斷奶仔豬十二指腸中ZO-1基因表達(dá)上調(diào)（P＞0.05），Occludin基因表達(dá)略下調(diào)（P＞0.05），空腸中ZO-1基因表達(dá)略下調(diào)（P＞0.05），Occludin基因表達(dá)上調(diào)（P＞0.05），其原因還需進(jìn)一步探究。

3.3 發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑對(duì)斷奶仔豬腸道菌群的影響

動(dòng)物在健康情況下腸道內(nèi)微生物菌群維持平衡狀態(tài)，斷奶后仔豬在飲食、飼養(yǎng)等方面發(fā)生劇烈變化，易誘發(fā)由斷奶應(yīng)激導(dǎo)致的腸道微生物菌落紊亂、失衡，使得大腸桿菌等有害菌數(shù)量增加，乳酸桿菌等有益菌數(shù)量減少，導(dǎo)致仔豬腸道屏障能力迅速降低，極易誘發(fā)各種疾病［22］。韓劍眾等［23］研究發(fā)現(xiàn)由黃芪、當(dāng)歸、茯苓、柴胡和大黃等中藥的有效成分組成的合劑能明顯提高斷奶仔豬盲腸內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的含量，降低大腸桿菌的含量。宋良敏［24］用枯草芽孢桿菌、糞腸球菌等制成的復(fù)合微生態(tài)飼料添加劑，添加到斷奶仔豬日糧中，發(fā)現(xiàn)腸道乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量增多，大腸桿菌的數(shù)量減少。本研究發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬日糧中添加抗生素在降低大腸桿菌數(shù)量的同時(shí)，顯著抑制了乳酸桿菌的生長(zhǎng)，而聯(lián)用發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑和微生態(tài)制劑，不僅能抑制大腸桿菌的增殖，還促進(jìn)了乳酸桿菌的生長(zhǎng)，且試驗(yàn)Ⅰ組效果要優(yōu)于試驗(yàn)Ⅱ組。

4 結(jié)論

在斷奶仔豬日糧中添加0.3%發(fā)酵中藥微生態(tài)制劑和0.15 g/kg枯草芽孢桿菌TL，可提高十二指腸、空腸和回腸VH/CD值，促進(jìn)盲腸內(nèi)容物乳酸桿菌繁殖，降低盲腸內(nèi)容物大腸桿菌數(shù)量，但對(duì)腸道基因表達(dá)作用不明顯。