鄺瑞彬，楊 敏，周陳平，楊 護，黃炳雄，魏岳榮

（廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣州 510640）

0 引言

西番蓮果實果汁酸甜，芳香可口，有很高的食用價值和藥用價值，具有廣闊的市場前景。西番蓮在中國南部廣泛種植，如廣東、廣西、福建、貴州、云南等西番蓮主產(chǎn)區(qū)2019年種植面積約達3.33萬hm2，產(chǎn)量近100萬t[1-2]。近年來中國西番蓮品種較單一，果實品質(zhì)有待提升，且莖基腐病、木質(zhì)化病毒病等病害多發(fā)，產(chǎn)量和果實品質(zhì)受到影響，經(jīng)濟效益嚴重受損，限制了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-4]。傳統(tǒng)的育種技術(shù)通常周期較長，且其遺傳基礎(chǔ)狹窄，難度大，需要花費大量的財力物力；運用現(xiàn)代分子育種技術(shù)實現(xiàn)西番蓮性狀的定向改良，培育和創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)抗逆的西番蓮新種質(zhì)是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向。

西番蓮有關(guān)組培再生與遺傳體系報道始于20世紀90年代末，前人報道的西番蓮遺傳轉(zhuǎn)化研究，多數(shù)基于葉片為外植體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，其轉(zhuǎn)化率較低，再生體系頻率低或周期長，不利于后續(xù)創(chuàng)制基因改良品種[5-7]。胚性細胞懸浮系生長速率快，穩(wěn)定，分散性好，細胞形狀及細胞團大小大致相同，在植物遺傳育種改良、原生質(zhì)體培養(yǎng)與雜交、次生代謝物培養(yǎng)等研究領(lǐng)域廣泛利用，如苜蓿、香蕉、水稻、白鶴芋、柳枝稷等[8-11]。目前，中國西番蓮的研究主要集中在其栽培技術(shù)及栽培生理、營養(yǎng)與加工品質(zhì)、病蟲害及其農(nóng)業(yè)防治技術(shù)等方面，但是關(guān)于西番蓮細胞工程，尤其是胚性細胞懸浮系的建立技術(shù)及等方面的研究尚未見報道[12-14]。本試驗研究并優(yōu)化西番蓮愈傷組織及懸浮細胞培養(yǎng)條件，形成高效、穩(wěn)定的西番蓮懸浮細胞系，為其建立遺傳轉(zhuǎn)化平臺和分子改良育種奠定重要基礎(chǔ)，對百香果產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展有重要的意義。

本研究以西番蓮無菌苗為研究材料，研究西番蓮愈傷組織的誘導及建立細胞懸浮系，并開展細胞懸浮系培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究，為進一步利用細胞工程和基因工程等生物育種研究提供良好的材料來源和技術(shù)方法。

1 材料和方法

1.1 西番蓮無菌苗制備

試驗材料為食用西番蓮品種（‘臺農(nóng)1號’百香果），采摘當年生植株開花后約60天健康無損的百香果果實，用75%酒精進行表面消毒，在超凈工作臺用無菌切割刀將果實對半切開，用鑷子將果籽夾出，剔出黑色種子，將種子置于萌發(fā)培養(yǎng)基MG中，MG培養(yǎng)基：MS，30 g/L蔗糖、7.5～7.8 g/L瓊脂，pH 5.8。培養(yǎng)條件為26～28℃，暗培養(yǎng)至發(fā)芽后，進行光/暗培養(yǎng)(2000 Lux，12/8h)，14天后備用。

1.2 愈傷組織的誘導和培養(yǎng)試驗

在超凈工作臺上將上述西番蓮幼苗取出，置于干凈器皿上，分別切取幼苗的嫩葉、胚軸、嫩莖和幼根為外植體，約0.5 cm/段，分別置于裝有愈傷誘導培養(yǎng)基(MC1)的培養(yǎng)皿中，28℃暗培養(yǎng)。每皿放置10段外植體，每個處理設(shè)置3個重復。MC1：2.0mg/L2,4-D，0.2g/L Glutamine，20 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂，MS培養(yǎng)基，pH 5.8。觀察記錄不同外植體的愈傷生長情況與狀態(tài)等。

選取西番蓮胚軸為外植體材料，誘導培養(yǎng)基中設(shè)置植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)的不同濃度處理進行愈傷誘導（表2）。每個處理每皿接種10段外植體，每個處理設(shè)置3次重復，觀察不同處理的愈傷組織的發(fā)生時間、顏色、狀態(tài)和長勢等，計算出愈率[15]。

待愈傷組織變大至1 cm左右，去除褐化部分組織，將切約0.5 cm大小的半透明較疏松愈傷組織，置于繼代培養(yǎng)基(MC2)的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3周繼代一次，連續(xù)繼代4～5代后，即可獲得米色或淡黃色、疏松、生長良好的西番蓮愈傷組織。MC2培養(yǎng)基：1.0 mg/L 2,4-D，0.2 g/L Glutamine，30 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂，MS，pH 5.8。

1.3 懸浮細胞培養(yǎng)及條件優(yōu)化試驗

1.3.1 西番蓮懸浮細胞的培養(yǎng) 在超凈工作臺上，選取米色或淡黃色、顆粒疏松、生長旺盛的西番蓮愈傷組織，置于懸浮系液體培養(yǎng)基(ML1)的三角瓶中，置于往恒溫振蕩器上28℃、80 r/min暗培養(yǎng)。ML1培養(yǎng)基：1.0 mg/L 2,4-D，0.2 g/L Glutamine，30 g/L蔗糖、MS，pH 5.8。1周后，用滅菌的20目不銹鋼篩網(wǎng)過濾懸浮細胞，保留能通過20目篩網(wǎng)的懸浮細胞繼續(xù)液體培養(yǎng)；培養(yǎng)2周后，同上述操作進行繼代培養(yǎng)。之后，每隔2～3周進行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代3～4代后利用倒置光學顯微鏡下細胞形態(tài)觀察，獲得比較穩(wěn)定均質(zhì)的西番蓮懸浮細胞系，可作為后續(xù)培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗的細胞材料。

1.3.2 西番蓮細胞懸浮系培養(yǎng)條件優(yōu)化 培養(yǎng)條件的單因素試驗中以上述步驟建成的細胞懸浮系為研究材料，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為ML培養(yǎng)基：0.2 g/L Glutamine，0.05 mg/L kinetin，MS。設(shè)置不同 2,4-D水平(D0、D1、D2、D3、D4為0、1、2、3、4 mg/L)、蔗糖用量(S1、S2、S3、S4、S5、S6為20、30、40、50、60、70 g/L)、起始細胞用量(W1、W2、W3、W4、W5為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL)、pH(5.2、5.5、5.8、6.1、6.4)。28℃、100 r/min暗培養(yǎng)2周，測定細胞鮮重，TTC法測定懸浮系細胞活性[16-17]，計算每個處理設(shè)置3個重復，取其平均值，根據(jù)單因素水平試驗，確定因素水平進行正交試驗。培養(yǎng)2周，取樣測定懸浮細胞活性，計算懸浮細胞活性增長率，確定最優(yōu)培養(yǎng)基條件，并進行驗證試驗。

1.4 細胞生長曲線的測定

根據(jù)獲得細胞培養(yǎng)基最優(yōu)條件，進行懸浮細胞生長曲線的測定試驗，繼代后按照不同生長時間，每隔3天采樣，取2 mL細胞培養(yǎng)液，真空抽濾，測定細胞鮮重和懸浮系細胞活性，每個時期設(shè)置3次重復，計算懸浮細胞鮮重和細胞活性增長率。取適量懸浮細胞滴到載玻片中央，用光學顯微鏡觀察記錄對數(shù)生長時期西番蓮懸浮細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007軟件，數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS 19.0軟件；分析顯著性水平(P＜0.05)，采用Duncan新復極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體及激素水平對誘導西番蓮愈傷組織的影響

將西番蓮幼苗不同外植體接種于誘導培養(yǎng)基上，7～14天后誘導出不同類型的愈傷組織（表1）。其中胚軸處理的出愈率最高(86.7%)，愈傷產(chǎn)生時間最早，第7天開始出現(xiàn)愈傷，幼根出愈率最低(40.0%)，誘導愈傷最慢，2周后開始產(chǎn)生愈傷。不同外植體產(chǎn)生的愈傷顏色和狀態(tài)也略有不同。其中胚軸產(chǎn)生的愈傷為半透明米白色，呈疏松顆粒狀，生長良好；嫩葉愈傷則是透明白色的粉顆粒狀，較疏松，但生長較慢；幼根愈傷組織則是黃褐色的較緊實塊狀物，生長較慢。嫩莖的出愈率僅次于胚軸，愈傷為米白色、塊狀、較疏松的，但是愈傷生長較緩慢。綜上，幼苗胚軸是比較適用于誘導愈傷組織的外植體。

表1 不同外植體誘導愈傷組織的反應(yīng)

選取幼苗胚軸為外植體，研究不同激素水平對西番蓮愈傷組織的誘導的影響。結(jié)果如表2所示，2,4-D激素處理可誘導出透明或半透明米白色疏松的顆粒狀的愈傷組織，其中2,4-D為2.0 mg/L的處理出愈率最高(83.3%)，誘導時間最短，生長較快，不同時期的愈傷組織生長如圖1所示，約30天后即可獲得較為疏松的、狀態(tài)良好的愈傷。使用6-BA和NAA的處理中，誘導時間較長，出愈率較低(36.7%～43.3%)愈傷為黃褐色，少量長根，生長較慢。

表2 不同激素水平誘導西番蓮胚軸愈傷組織的反應(yīng)

圖1 西番蓮胚軸愈傷組織誘導不同時期生長狀況

綜上所述，西番蓮愈傷誘導的外植體最佳選擇是幼苗胚軸，誘導培養(yǎng)基中激素采用2.0 mg/L 2,4-D比較適合，此條件下，約1個月后產(chǎn)生半透明米白色、疏松且生長狀態(tài)良好的愈傷組織。

2.2 西番蓮懸浮細胞培養(yǎng)條件的研究

2.2.1 單因素試驗 優(yōu)化培養(yǎng)條件的單因素試驗中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，設(shè)置不同2,4-D水平、起始細胞用量、蔗糖用量和培養(yǎng)基pH條件，培養(yǎng)2周后，測定并計算細胞鮮重和懸浮系細胞活性增長率，結(jié)果如圖2～5所示。西番蓮懸浮細胞培養(yǎng)條件在2,4-D濃度為0 mg/L時，細胞鮮重和活性增長極慢（圖2），隨著激素的增加呈上升趨勢，在2,4-D濃度為2.0 mg/L兩者達到最大值，隨后增至3.0和4.0 mg/L時，細胞鮮重和活性增長率逐漸降低。起始細胞用量水平也影響著細胞鮮重和活性增長率（圖3），兩者隨著起始細胞用量的增加呈上升趨勢，在8.0 mg/mL時為活性最高，用量增至10.0 mg/mL后，盡管鮮重增長率仍處于上升態(tài)勢，但活性增長率開始降低，細胞液由微黃色變?yōu)槲⒑稚Ｅ囵B(yǎng)基pH條件對細胞鮮重與活性影響不同，在pH為5.5時，細胞鮮重增長率最高，隨著pH的提高，增長率逐步降低；在細胞活性增長率中，pH 5.5和6.1時，出現(xiàn)2個增長峰，在pH 5.8時，增長率略有下降。培養(yǎng)基的蔗糖用量同樣影響細胞鮮重和活性的增長率，細胞鮮重和活性增長率在蔗糖用量為30 g/L時最高，隨著用量增加而降低，活性增長率在蔗糖用量為60 g/L時出現(xiàn)一個小高峰，蔗糖用量增至70 g/L時鮮重和活性增長率降低，細胞由微黃色轉(zhuǎn)至黃褐色。

圖2 不同2,4-D濃度對西番蓮懸浮細胞生長及活性的影響

圖3 不同細胞起始用量對西番蓮懸浮細胞生長及活性的影響

圖4 培養(yǎng)基pH對西番蓮懸浮細胞生長及活性的影響

圖5 蔗糖處理對西番蓮懸浮細胞生長及活性的影響

2.2.2 正交試驗 綜合以上單因素試驗結(jié)果，設(shè)置2,4-D水平、起始細胞用量、蔗糖用量和pH條件四個因素三個水平進行L9(34)正交試驗（表3），以確定西番蓮懸浮細胞培養(yǎng)最佳條件。正交試驗結(jié)果如表4所示，影響西番蓮懸浮系細胞活性大小的順序是S＞P＞D＞W(wǎng)，即蔗糖用量＞pH＞2,4-D水平＞起始細胞用量，蔗糖用量是影響懸浮細胞活性的主要因素，起始細胞用量對細胞活性的影響為四者最小，最佳組合S1P3D2W2，即蔗糖濃度為30 g/L、pH6.1、2,4-D 2 mg/L和起始細胞用量為6.0 mg/mL。方差分析顯示蔗糖濃度(S)對懸浮細胞活性的影響顯著(P＜0.05)，其余因素未達顯著水平。

表3 L9(34)正交試驗設(shè)計

表4 不同因素組合對西番蓮細胞懸浮培養(yǎng)的影響

根據(jù)最佳組合進行驗證試驗，培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和蔗糖濃度為30 g/L、pH 6.1、2,4-D 2.0 mg/L和起始細胞用量為6.0 mg/mL，培養(yǎng)2周后，細胞活性增長率為1030.9%，與正交試驗結(jié)果相近。

2.3 西番蓮細胞懸浮系生長曲線

以上述獲得的最優(yōu)培養(yǎng)條件配置細胞培養(yǎng)基對懸浮系進行培養(yǎng)，在不同時期觀察測試懸浮細胞的生長情況，結(jié)果如圖6所示。剛開始培養(yǎng)3天內(nèi)，細胞處于恢復階段，細胞鮮重和細胞活性變化不大，隨著培養(yǎng)時期的延長，細胞鮮重和細胞活性增長率逐漸提高，慢慢進入對數(shù)生長期，在第6～12天增長較快速，其中懸浮細胞活性增長率最大值出現(xiàn)在第15天，隨后緩慢降低；而鮮重增長率最大值在第24天，隨后慢慢降低，營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快，培養(yǎng)基開始變混濁，至30天時細胞液呈現(xiàn)微褐色，在培養(yǎng)瓶壁上可見衰敗細胞。本試驗條件下，西番蓮懸浮細胞繼代最佳時期為12～18天，此時細胞活力最強且細胞鮮重較高。利用光學顯微鏡對對數(shù)生長期的細胞進行形態(tài)觀察（圖7），結(jié)果顯示西番蓮懸浮細胞較為均勻一致，細胞呈近圓形或短柱形，多為微細胞團和少量單細胞，細胞生長旺盛，細胞質(zhì)濃厚。

圖6 西番蓮懸浮細胞生長曲線

圖7 西番蓮懸浮細胞形態(tài)（對數(shù)生長期）

3 討論與結(jié)論

通過基因工程技術(shù)進行植物遺傳改良，可望克服傳統(tǒng)育種的限制因素而達到果樹品種改良和實現(xiàn)快繁的目的，是近年果樹育種的發(fā)展趨勢。研究愈傷組織的誘導和細胞培養(yǎng)的適宜條件，是建立理想的遺傳改良受體——胚性細胞懸浮系的的前提。本試驗研究并優(yōu)化西番蓮愈傷組織及細胞懸浮系培養(yǎng)條件，形成高效、穩(wěn)定的西番蓮細胞懸浮系，為西番蓮細胞工程及遺傳改良創(chuàng)制新種質(zhì)提供重要的基礎(chǔ)。

愈傷組織誘導效率受外植體種類、培養(yǎng)基組成及激素種類和水平、培養(yǎng)的條件等因素影響[18-20]。普遍采

用的外植體有胚軸、葉片、莖段、莖尖、根系、花器官等[17,21-22]。細胞分裂素和生長素是最常用的植物生長調(diào)節(jié)劑，生長素以2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)使用最為廣泛，細胞分裂素則6-芐氨基嘌呤(6-BA)為主，兼有苯基脲類衍生物(TDZ)[10-11,21-22]。培養(yǎng)基中的激素種類和濃度是影響細胞生長及狀態(tài)的重要因子，胚性組織愈傷組織優(yōu)于非胚性愈傷組織，胚性愈傷組織一般比較疏松、繁殖生長較快，繼代穩(wěn)定后可用于培養(yǎng)懸浮細胞系[17,22]。本研究試驗結(jié)果表明，西番蓮愈傷誘導的外植體最佳選擇是幼苗胚軸，誘導培養(yǎng)基中激素添加2.0 mg/L 2,4-D，誘導培養(yǎng)一個月左右產(chǎn)生半透明米白色、疏松且生長狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，與前人在香蕉、白刺花等研究結(jié)果較為相似[23-24]。

穩(wěn)定的胚性愈傷組織細胞可用于培養(yǎng)懸浮細胞，懸浮細胞的生長受起始細胞用量、培養(yǎng)基激素、碳水化合物供給和pH等因素的影響[25]。與愈傷組織誘導相似，培養(yǎng)基中2,4-D用量影響懸浮細胞的生長與活性。研究表明2,4-D能促進細胞生長，限制細胞進一步分化，使細胞呈較穩(wěn)定脫分化狀態(tài)[10,26]。在本試驗中，2,4-D為2.0 mg/L時，懸浮細胞增殖最快，活性最高，此時細胞質(zhì)豐富，形狀較為規(guī)整，細胞核大；增至4 mg/L時，細胞增殖速度降低，呈現(xiàn)微褐色，可能產(chǎn)生酚類物質(zhì)含量增多。起始細胞用量即接種量影響懸浮體系，因為植物細胞具有群聚性，在細胞初始密度與營養(yǎng)物比例合理，才能較好促進細胞分裂生長，培養(yǎng)效果才能達到理想狀態(tài)[27-28]。本試驗中，西番蓮起始細胞用量在低于4.0 mg/mL時，活性和鮮重增長率較緩慢，在8.0 mg/mL時為細胞活性最高，用量增至10.0 mg/mL后，活性增長率開始降低，死細胞增多，細胞液由微黃色變?yōu)槲⒑稚?。于波等[10]在白鶴芋懸浮細胞在起始濃度0.3 g時較為適宜細胞的分裂和生長，過高和過低則起限制作用。蔗糖為懸浮細胞提供碳源營養(yǎng)，同時調(diào)節(jié)滲透壓高低。當蔗糖濃度過低，不足以維持細胞的生長，細胞質(zhì)不夠豐富，體積較小，隨著蔗糖濃度的升高，培養(yǎng)液中的滲透壓過高也會影響懸浮細胞的生長[10,25]。在本試驗中，培養(yǎng)液蔗糖濃度30 g/L時細胞鮮重和活性增長率為最高，隨著濃度增加，至70 g/L時細胞活性最低，由微黃色轉(zhuǎn)至黃褐色，與前人研究結(jié)果較為一致[10,29]。培養(yǎng)液pH同樣會影響細胞生長與狀態(tài)，本研究結(jié)果中pH為5.5～6.1時細胞鮮重和活性增長率比較高；鄒瑞等[16]發(fā)現(xiàn)諾麗懸浮細胞培養(yǎng)液pH在4.5～5.0范圍內(nèi)生長最為旺盛；叢林曄等[30]認為pH值為6.0的培養(yǎng)基中水稻懸浮細胞密度增長最快。

在本試驗中，細胞培養(yǎng)優(yōu)化條件下，西番蓮懸浮細胞生長曲線呈“S”形。在繼代初期時，細胞生長延遲期出現(xiàn)在增殖培養(yǎng)的0～6天內(nèi)；較快速生長的細胞對數(shù)增長期則出現(xiàn)在第6天后，細胞鮮重和細胞活性增長率較高；隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，雖然細胞不斷增值，細胞之間相互競爭逐漸減少的營養(yǎng)物質(zhì)；第15天后細胞活性增長率逐漸降低，第18～24天細胞生長進入穩(wěn)定期，在24～30天后生長停緩、部分細胞褐化及凋亡。本試驗條件下，西番蓮懸浮細胞繼代最佳時期為12～18天，此時細胞活力較強且細胞鮮重較高，可以維持懸浮細胞系生長的穩(wěn)定性。

本研究利用幼芽莖段誘導愈傷組織，建立了穩(wěn)定的西番蓮胚性細胞懸浮系。本研究結(jié)果認為西番蓮愈傷誘導的外植體最佳選擇是幼苗胚軸，誘導培養(yǎng)基中激素適宜采用2.0 mg/L 2,4-D，約1個月后產(chǎn)生半透明米白色、疏松且生長狀態(tài)良好的愈傷組織。懸浮細胞培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和蔗糖濃度為30 g/L、pH 6.1、2,4-D 2.0 mg/L和起始細胞用量為6.0 mg/mL，此條件下建立的細胞懸浮系均勻一致，細胞密度大，細胞質(zhì)濃厚，細胞生長旺盛，能在短期內(nèi)提供大量懸浮細胞，為后續(xù)西番蓮利用懸浮系建立高效細胞工程及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系提供良好的材料和技術(shù)基礎(chǔ)。