郭建敏，郭利飛，趙廷彬，李鎮(zhèn)江，江源剛，葉莉，唐曉芳，楊志剛，喬長(zhǎng)晟*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津慧智百川生物技術(shù)有限公司，天津 300457；4.四川百川金開(kāi)生物工程有限公司，四川 成都 610000；5.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院有限公司，四川 成都 610000）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由 D-谷氨酸和L-谷氨酸通過(guò)γ-羧基和α-氨基之間的酰胺鍵連接的陰離子均聚酰胺[1]，其分子量大小在104kDa～108kDa之間[2]。γ-PGA是一種水溶性的可食用高分子氨基酸聚合物，其不具備免疫原性，對(duì)人體無(wú)害，且生物可降解[3]。由于具有這些特性，它在食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)和廢水處理領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[4-8]。自從Lvanovice在炭疽芽孢桿菌中第一次發(fā)現(xiàn)γ-PGA[9]，至今已經(jīng)報(bào)道了多種產(chǎn)γ-PGA的芽孢桿菌，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。產(chǎn)生 γ-PGA的菌株根據(jù)生物聚合物生產(chǎn)對(duì)L-谷氨酸的需求分為兩類：L-谷氨酸依賴性和非依賴性菌株。依賴于L-谷氨酸的菌株，在其培養(yǎng)基中添加前體物L(fēng)-谷氨酸能夠高水平地生物合成γ-PGA[10]。由于非依賴性菌株發(fā)酵γ-PGA產(chǎn)量不高，當(dāng)前市場(chǎng)上主要利用L-谷氨酸依賴性菌株進(jìn)行γ-PGA生產(chǎn)[11]。

在獲得高產(chǎn)菌株的前提下，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（如碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等）、優(yōu)化發(fā)酵條件（如溫度、pH值、溶氧等）、選擇合適的發(fā)酵方式（如分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵等）是提高γ-PGA產(chǎn)量的重要手段[12-13]。在分批發(fā)酵中，一次性投料過(guò)多容易造成發(fā)酵液環(huán)境突變，不利于菌種生長(zhǎng)代謝和目標(biāo)產(chǎn)物的積累[14]。分批補(bǔ)料發(fā)酵是在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度進(jìn)行控制，給菌體提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，使菌體的生產(chǎn)狀態(tài)保持最大化，同時(shí)提高底物消耗利用率，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物提升的手段。王云龍等[15]通過(guò)分批補(bǔ)料蔗糖、蛋白胨、玉米漿，將L-天冬酰胺酶的酶活提高到了1 413.60 U/mL，較分批發(fā)酵提升了66.20%。Huang等[16]通過(guò)優(yōu)化初始酵母膏、L-谷氨酸濃度以及分批流加葡萄糖的方法，將γ-PGA產(chǎn)量提高到了101.10 g/L。Kongklom等[17]通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加葡萄糖、檸檬酸和氯化銨的方法，將γ-PGA的產(chǎn)量提高到39.60 g/L。

本文利用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.3336生產(chǎn)γ-PGA，使用葡萄糖和硫酸銨作為碳源和氮源，前期研究葡萄糖的最適初始濃度為90 g/L，硫酸銨的最適初始濃度為7 g/L[18]。在γ-PGA生產(chǎn)過(guò)程中，存在葡萄糖和氨氮在發(fā)酵40 h左右就被消耗殆盡的情況，所以本研究采用分批補(bǔ)料發(fā)酵方式式，通過(guò)流加葡萄糖溶液和硫酸銨溶液，對(duì)發(fā)酵液中葡萄糖濃度和氨氮濃度進(jìn)行控制，并確定出持續(xù)補(bǔ)料時(shí)間，從而提升菌體生產(chǎn)γ-PGA的能力，為工業(yè)上高效生產(chǎn)γ-PGA提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.3336：天津北洋百川生物技術(shù)有限公司；硫酸鎂、硫酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸銨、硫酸鉀、葡萄糖（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；味精（工業(yè)級(jí)）：梅花生物科技集團(tuán)股份有限公司；酵母膏（食品級(jí)）：安琪酵母股份有限；酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨（食品級(jí)）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；TGL-16G高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；752紫外分光光度計(jì)：天津市光學(xué)儀器廠；SBA-40E生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所；LC-20AT高效液相色譜分析儀：日本島津儀器有限公司；GRJB-5D 5 L發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司；BIOTECH 30 L、200 L發(fā)酵罐：上海保興生物設(shè)備過(guò)程有限公司；NDJ-8S黏度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；YM滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

固體培養(yǎng)基：NaCl10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，瓊脂2%。調(diào)節(jié)初始 pH7.2～7.3，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L（單獨(dú)滅菌），酵母膏7 g/L，胰蛋白胨6 g/L，蛋白胨4 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，調(diào)節(jié)初始 pH7.2～7.3，121℃滅菌 20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：味精70g/L（單獨(dú)滅菌），葡萄糖90g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨5g/L，（NH4）2SO47g/L，K2SO415g/L，CaSO4·2H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g/L，甘油 60 mL/L。調(diào)節(jié)初始 pH7.2～7.3，121℃滅菌20 min。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：葡萄糖750 g/L（單獨(dú)滅菌），硫酸銨30 g/L（單獨(dú)滅菌）。

1.3.2 菌種培養(yǎng)方法

種子活化：在無(wú)菌操作臺(tái)用接種環(huán)從甘油管中蘸取2～3環(huán)菌液，劃線于固體培養(yǎng)基，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。然后將培養(yǎng)皿中的菌種挑起，并均勻涂抹于斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12 h。

種子培養(yǎng)：接種前將滅菌后的葡萄糖溶液轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，然后使用接種環(huán)將活化好的菌種斜面接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL無(wú)擋板三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為220 r/min的37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)14 h～16 h。

5L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：接種前投入單獨(dú)滅菌的味精600mL，調(diào)初始pH7.2～7.3，將300mL種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，總裝液量達(dá)到3 L。調(diào)節(jié)通風(fēng)量為1.25 m3/（m3·min），攪拌轉(zhuǎn)速為400 r/min，溫度為37℃，罐壓為0.02 MPa，培養(yǎng)72 h。

30 L種子罐培養(yǎng)：在無(wú)菌操作室內(nèi)將試管中的菌體斜面使用無(wú)菌水洗起，均勻涂抹于2個(gè)裝有固體培養(yǎng)基的茄子瓶中，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。然后將茄子瓶中菌體用無(wú)菌水洗起，與單獨(dú)滅菌好的葡萄糖一起轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的30 L種子罐中，總裝液量達(dá)到15 L，調(diào)節(jié)通風(fēng)量為1.25 m3/（m3·min），攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min，溫度為37℃，罐壓為0.02 MPa，培養(yǎng)至 OD660達(dá)到 0.21～0.23。

200 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：使用外置管路將30 L種子罐的15 L種子液導(dǎo)入裝有135 L發(fā)酵培養(yǎng)基的200 L發(fā)酵罐中，調(diào)節(jié)通風(fēng)量為1.25 m3/（m3·min），攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min，溫度為37℃，罐壓為0.02 MPa，發(fā)酵72 h。

1.3.3 葡萄糖和硫酸銨流加方法

在發(fā)酵過(guò)程中，菌種在不同生長(zhǎng)階段對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗速率是不同的，所以采用變速流加方法，選取1.0、1.5、2.0 g/（L·h）為補(bǔ)料速率。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度低于2、5、15、25 g/L時(shí)，開(kāi)始流加濃度為750 g/L的葡萄糖溶液，使發(fā)酵液中的葡萄糖濃度維持在 2 g/L～5 g/L、5 g/L～15 g/L、15 g/L～25 g/L、25 g/L～35 g/L（葡萄糖濃度處于不同濃度范圍的臨界值時(shí)，作為小于當(dāng)前濃度處理）；當(dāng)發(fā)酵液中氨氮濃度低于0.1、0.5、1.0g/L時(shí)，流加濃度為75g/L的硫酸銨溶液，使發(fā)酵液中的氨氮濃度維持在 0.1 g/L～0.5 g/L、0.5 g/L～1.0 g/L、1.0 g/L～1.5 g/L（氨氮濃度處于不同濃度范圍的臨界值時(shí)，作為小于當(dāng)前濃度處理）。

1.3.4 分析計(jì)算

1.3.4.1 菌體濃度測(cè)定

取1 mL發(fā)酵液至25 mL容量瓶，定容后以蒸餾水作為空白對(duì)照，采用分光光度計(jì)測(cè)定660 nm處的吸光度（OD660），稀釋倍數(shù)為固定數(shù)值25，用OD660表示菌體濃度。菌體濃度計(jì)算公式如下。

1.3.4.2 葡萄糖和谷氨酸濃度測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液，在15 000 r/min條件下離心15 min，取1 mL上清液至100 mL容量瓶，定容后采用SBA-40生物傳感器測(cè)定葡萄糖濃度和谷氨酸濃度。

1.3.4.3 氨氮濃度檢測(cè)

氨氮濃度采用奈斯勒試劑，通過(guò)比色法測(cè)定[19]。

1.3.4.4 γ-PGA含量的測(cè)定

首先取1 mL上清液至50 mL容量瓶中，純凈水定容，然后使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，最后采用高效液相色譜分析儀檢測(cè)γ-PGA含量；色譜柱條件：Shodx SB-800HQ凝膠滲透色譜柱，0.05 mol/L無(wú)水硫酸鈉緩沖液洗脫，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積 20 μL。

1.3.4.5 生產(chǎn)強(qiáng)度的計(jì)算

生產(chǎn)強(qiáng)度計(jì)算公式如下。

式中：Y 為 γ-PGA 含量，g/L；t為發(fā)酵時(shí)間，d。

1.3.4.6 谷氨酸利用率的計(jì)算

谷氨酸利用率計(jì)算公式如下。

式中：M1為初始谷氨酸濃度，g/L；M2為發(fā)酵結(jié)束時(shí)谷氨酸濃度，g/L。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理及作圖均使用Origin軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 維持不同葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵γ-PGA的影響

當(dāng)葡萄糖濃度低于2、5、15、25 g/L時(shí)，采用分批補(bǔ)料發(fā)酵方式對(duì)發(fā)酵液的葡萄糖濃度進(jìn)行控制。通過(guò)對(duì)發(fā)酵液的OD660、pH值、葡萄糖濃度、谷氨酸濃度、黏度、γ-PGA產(chǎn)量的測(cè)定，明確維持不同葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵γ-PGA的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 維持不同葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵γ-PGA含量的影響Fig.1 Effects of different glucose concentrations on fermentation of γ-PGA

如圖1所示，不進(jìn)行葡萄糖流加，菌體在48 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD660達(dá)到0.44，谷氨酸濃度為31 g/L，γ-PGA 產(chǎn)量達(dá)到（34.01±0.53）g/L。當(dāng)葡萄糖濃度維持在2 g/L～5 g/L、5 g/L～15 g/L，發(fā)酵72 h結(jié)束時(shí)，OD660皆達(dá)到了0.54；菌體進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期的時(shí)間分別為51、54 h，指數(shù)生長(zhǎng)期分別延長(zhǎng)了3、6 h；發(fā)酵液中的谷氨酸濃度為28 g/L和25 g/L，谷氨酸利用率較不補(bǔ)料發(fā)酵提升了7.69%和15.38%；γ-PGA含量分別為（35.47±0.45）g/L 和（37.51±0.61）g/L，較不補(bǔ)料發(fā)酵提升了4.29%和10.29%。當(dāng)葡萄糖濃度維持15 g/L～25 g/L、25 g/L～35 g/L，發(fā)酵 72 h結(jié)束時(shí) OD660分別為0.44、0.40；菌體進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期的時(shí)間分別為45、42 h，指數(shù)生長(zhǎng)期分別縮短了3、6 h；發(fā)酵液中的谷氨酸濃度為33 g/L和39 g/L，谷氨酸利用率較不補(bǔ)料發(fā)酵降低了6.45%和25.80%；γ-PGA含量分別為（28.29±0.75）g/L和（27.51±0.73）g/L，較不補(bǔ)料發(fā)酵降低了16.81%和19.11%。

經(jīng)過(guò)分析可知，γ-PGA伴隨著菌體的生長(zhǎng)發(fā)育而積累，積累速率與生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)。在菌體處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，γ-PGA的積累速率最大，隨著菌種進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，γ-PGA的積累變緩。當(dāng)菌體生長(zhǎng)發(fā)育面臨營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏時(shí)，谷氨酸鈉也可能被作為碳源和氮源所消耗利用[11]。維持葡萄糖濃度在2 g/L～5 g/L、5 g/L～15 g/L，有利于菌體的生長(zhǎng)發(fā)育，使得菌體的指數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)并保持一定的γ-PGA生產(chǎn)活性；進(jìn)一步促進(jìn)了底物谷氨酸的消耗利用，使得γ-PGA產(chǎn)量提高。維持葡萄糖濃度在 15 g/L～25 g/L、25 g/L～35 g/L 時(shí)，高濃度的碳源會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)發(fā)育造成不同程度的抑制，使菌體提前進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，γ-PGA積累速率下降。在維持葡萄糖濃度為25 g/L～35 g/L時(shí)，出現(xiàn)了發(fā)酵液pH值明顯高于其他試驗(yàn)組的情況，這可能是因?yàn)檫^(guò)高的碳源濃度造成菌體產(chǎn)生過(guò)量的副產(chǎn)物所引起的[20]，不利于γ-PGA的積累。綜上所述，選擇合適的補(bǔ)料時(shí)機(jī)并維持適宜的葡萄糖濃度，對(duì)菌體的生長(zhǎng)發(fā)育和γ-PGA的積累具有一定的促進(jìn)作用，所以選擇在發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度低于5 g/L時(shí)，通過(guò)流加葡萄糖溶液維持葡萄糖濃度在5 g/L～15 g/L。

2.2 維持不同氨氮濃度對(duì)發(fā)酵γ-PGA的影響

氮源作為菌體生長(zhǎng)代謝的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能直接影響到發(fā)酵過(guò)程中氨基酸的代謝合成[21]。硫酸銨作為微生物發(fā)酵的速效氮源，是培養(yǎng)基中氨氮營(yíng)養(yǎng)的合適補(bǔ)充者[22]。在分批發(fā)酵過(guò)程中，氨氮質(zhì)量濃度一般會(huì)在42 h降至0.1 g/L以下。在控制培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的同時(shí)，采用變速流加方式流加硫酸銨溶液，控制發(fā)酵液中氨氮濃度，以保障菌體生長(zhǎng)發(fā)育和目標(biāo)代謝產(chǎn)物積累。設(shè)計(jì)了維持氨氮濃度在0.1 g/L～0.5 g/L、0.5 g/L～1.0 g/L、1.0 g/L～1.5 g/L 3 種方法，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 維持不同氨氮濃度對(duì)發(fā)酵γ-PGA的影響Fig.2 Effects of maintaining different ammonia concentration on fermentation of γ-PGA

從圖2可以看出，不同氨氮濃度對(duì)OD660、谷氨酸濃度、γ-PGA產(chǎn)量影響較大。只補(bǔ)料葡萄糖，發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD660為0.56，谷氨酸濃度為25 g/L，γ-PGA產(chǎn)量為（37.51±0.64）g/L；當(dāng)維持氨氮濃度在 0.1 g/L～0.5 g/L、0.5 g/L～1.0 g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí) OD660為 0.65、0.54，谷氨酸濃度為20 g/L和18 g/L，谷氨酸利用率較只流加葡萄糖提升了13.52%和18.93%，γ-PGA產(chǎn)量為（42.36±0.70）g/L 和（45.29±0.81）g/L，較只流加葡萄糖提高了12.93%和20.74%；當(dāng)維持氨氮濃度為1.0 g/L～1.5 g/L，發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD660為0.39，谷氨酸濃度為29 g/L，γ-PG產(chǎn)量為（31.71±0.65）g/L，較只補(bǔ)料葡萄糖均出現(xiàn)了明顯下降。

由圖2分析可知，隨著氨氮濃度逐漸提高，OD660、谷氨酸消耗量和γ-PGA產(chǎn)量均出現(xiàn)先升高后下降的情況。這表明將硫酸銨和葡萄糖搭配流加并維持其濃度在適宜范圍，有利于菌體生長(zhǎng)發(fā)育和保持菌體胞內(nèi)酶的活性，使得菌體增加了對(duì)底物的消耗利用，尤其谷氨酸利用率大幅增加，促進(jìn)了γ-PGA的合成積累。但如果提供的氨氮量超過(guò)了菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所需，會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)發(fā)育造成不同程度的抑制，使得菌種過(guò)早進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期或者穩(wěn)定生長(zhǎng)期縮短提前進(jìn)入衰亡期，這都會(huì)造成γ-PGA合成量下降。此外，氨氮的補(bǔ)充大大提高了菌體對(duì)底物谷氨酸的利用。綜上所述，當(dāng)發(fā)酵液中氨氮濃度低于0.5 g/L時(shí)，通過(guò)流加硫酸銨溶液將氨氮濃度控制在0.5 g/L～1.0 g/L有利于γ-PGA發(fā)酵。

2.3 不同持續(xù)流加時(shí)間對(duì)發(fā)酵γ-PGA的影響

考慮到菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求量會(huì)因菌體所處生長(zhǎng)階段不同而發(fā)生變化，探究了葡萄糖溶液和硫酸銨溶液的持續(xù)流加時(shí)間對(duì)發(fā)酵γ-PGA產(chǎn)量的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同持續(xù)流加時(shí)間對(duì)發(fā)酵γ-PGA產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of different duration on fermentation of γ-PGA

由表1所示，在發(fā)酵54 h前進(jìn)行葡萄糖、硫酸銨溶液流加補(bǔ)料，使得OD660、谷氨酸消耗量、產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度隨著補(bǔ)料持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。持續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨溶液12 h，發(fā)酵液最終OD660達(dá)到0.61，谷氨酸含量為17 g/L，γ-PGA產(chǎn)量為46.19 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到15.38 g/（L·d）。如發(fā)酵54 h后繼續(xù)流加葡萄糖溶液和硫酸銨溶液，會(huì)造成菌體量下降或菌體活性降低，對(duì)γ-PGA的合成積累沒(méi)有促進(jìn)作用。

由表1可知，發(fā)酵培養(yǎng)54 h是地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.3336生長(zhǎng)發(fā)育和積累γ-PGA的一個(gè)重要臨界點(diǎn)。持續(xù)流加葡萄糖、硫酸銨溶液12 h可以使菌種的指數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定生長(zhǎng)期得到不同程度地延長(zhǎng)，且在穩(wěn)定生長(zhǎng)期時(shí)能保持一定的γ-PGA代謝活性，增加了底物谷氨酸的消耗轉(zhuǎn)化，合成積累更多γ-PGA；在54 h停止流加補(bǔ)料，發(fā)酵液中的葡萄糖和氨氮在后續(xù)發(fā)酵中被耗盡，避免了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的浪費(fèi)。適當(dāng)?shù)牧骷訒r(shí)間，不僅可以避免碳源和氮源提供過(guò)多對(duì)菌體生長(zhǎng)發(fā)育和γ-PGA生產(chǎn)積累造成不利影響，還可以減少生產(chǎn)成本的增加。此外，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中的葡萄糖耗盡更有利于γ-PGA的提取純化[16]。因此，確定12 h為葡萄糖、硫酸銨溶液最適流加時(shí)間。

2.4 200 L罐放大驗(yàn)證

為了驗(yàn)證分批補(bǔ)料發(fā)酵條件優(yōu)化后菌體發(fā)酵性能的穩(wěn)定性，利用200 L發(fā)酵罐進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，在200 L發(fā)酵罐中，加料量進(jìn)一步擴(kuò)大。200 L發(fā)酵罐生產(chǎn)γ-PGA各參數(shù)隨時(shí)間變化情況見(jiàn)圖3。

圖3 200 L發(fā)酵罐生產(chǎn)γ-PGA各參數(shù)隨時(shí)間變化情況Fig.3 The variation of γ-PGA parameters in 200 L fermentation tank with time

由圖3可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中OD660、pH值、葡萄糖濃度、谷氨酸濃度、氨氮濃度、γ-PGA積累量的變化趨勢(shì)與5 L罐發(fā)酵基本一致，連續(xù)3次分批補(bǔ)料發(fā)酵均可穩(wěn)定高產(chǎn)γ-PGA。菌體發(fā)酵72 h后，菌體OD660達(dá)到了0.62，較不補(bǔ)料發(fā)酵前提高了39.01%，谷氨酸利用率為77.14%，較不補(bǔ)料發(fā)酵提高了38.47%，γ-PGA產(chǎn)量為（47.09±0.82）g/L，較不補(bǔ)料發(fā)酵提高了38.45%。200 L罐發(fā)酵水平略優(yōu)于5 L罐發(fā)酵，這可能是由于200 L發(fā)酵罐高徑比大于5 L發(fā)酵罐，增加了發(fā)酵液的傳質(zhì)系數(shù)，提升了氧氣的利用率。這一結(jié)果驗(yàn)證了在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行的分批補(bǔ)料優(yōu)化成果，即通過(guò)分批補(bǔ)料流加方式對(duì)發(fā)酵液中葡萄糖和氨氮進(jìn)行適宜補(bǔ)充和控制，能夠顯著提升菌體生長(zhǎng)和γ-PGA合成。

3 結(jié)論

本研究分別以葡萄糖和硫酸銨作為碳源和氮源，采用變速流加方法補(bǔ)料，對(duì)發(fā)酵液中葡萄糖濃度和氨氮濃度的控制范圍以及持續(xù)控制時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度低于5 g/L，氨氮濃度低于0.5 g/L時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)料。在200L發(fā)酵罐中，葡萄糖濃度控制在5 g/L～15 g/L，氨氮濃度控制在0.5 g/L～1.0g/L，持續(xù)控制12 h進(jìn)行γ-PGA分批補(bǔ)料發(fā)酵，菌體的指數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)了6 h，菌體量明顯提升，發(fā)酵72 h結(jié)束時(shí)OD660達(dá)到了0.62，并且菌體處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期仍合成大量γ-PGA，谷氨酸濃度降至了16 g/L，γ-PGA生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到了15.69 g/（L·d），最終發(fā)酵液中γ-PGA產(chǎn)量達(dá)到了（47.09±0.82）g/L。相對(duì)于不補(bǔ)料發(fā)酵，菌體量提升了39.01%，谷氨酸利用率提高了38.47%，γ-PGA生產(chǎn)強(qiáng)度和產(chǎn)量均提高了38.45%。這一結(jié)果對(duì)實(shí)現(xiàn)γ-PGA高效發(fā)酵具有借鑒意義。