陳瑜，許丹，何鵬飛，方益，孟春英，張小軍*

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點漁場漁業(yè)資源科學觀測實驗站，浙江 舟山 316021；3.浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江 舟山 316021）

銹斑蟳（Charybdis feriatus Linnaeus）為梭子蟹科（Portunidae）蟳屬（Charybdis）動物，俗稱“斑紋蟳”、“花蟹”、“十字蟹”等，分布在我國東海和南海淺海海域[1]，主要捕撈季節(jié)為夏秋季。銹斑蟳肉質(zhì)鮮美緊實，口感媲美梭子蟹和青蟹，其營養(yǎng)價值較高，除了作為鮮食外還被加工成切蟹和罐制品等。銹斑蟳在加工過程中會產(chǎn)生一系列副產(chǎn)物如蟹殼、蟹腳及蒸煮液，有食品企業(yè)將蟹殼作為盛放蟹肉的容器，填充蟹肉等輔料后加工成冷凍預制產(chǎn)品；在蟹殼中還可以提取出甲殼素、葡萄胺等活性物質(zhì)[2]，蟹鉗可直接冷凍銷售或裹粉油炸制作成小吃，因此銹斑蟳是一種發(fā)展前景良好的海水養(yǎng)殖品種。

近年來，海產(chǎn)品蒸煮液開發(fā)利用熱度提高，對加工過程產(chǎn)生的蒸煮液回收利用不但可以減少對環(huán)境的污染，更有助于水產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的高值化利用。于亞輝等[3]以鮑魚蒸煮液為原料，通過美拉德反應制備了海鮮風味基料；陳啟航等[4]以金槍魚蒸煮液作為原料，制備了風味海鮮調(diào)味汁。銹斑蟳蒸煮液中含有蛋白質(zhì)、核苷酸、氨基酸等多種營養(yǎng)成分和風味物質(zhì)，是開發(fā)天然功能性海鮮調(diào)味料的理想基料。本研究參考幾種經(jīng)濟海產(chǎn)品蒸煮液酶解工藝，利用堿性蛋白酶和風味蛋白酶對銹斑蟳蒸煮液進行分步酶解，分析蒸煮液和酶解液中氨基酸組成和滋味成分，為深入挖掘銹斑蟳酶解液潛在價值、開發(fā)酶解液加工產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銹斑蟳蒸煮液：舟山興泰水產(chǎn)有限公司；堿性蛋白酶（2.0×105U/g）、風味蛋白酶（1.5×104U/g）：北京索寶生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、磺基水楊酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氨基酸標準品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；核苷酸標準品：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：邦西儀器科技（上海）有限公司；L-8900型氨基酸自動分析儀：日本日立高新技術(shù)公司；50/30 μm PDMS/CAR/DVB（2 cm）萃取纖維頭：美國Supelco公司；7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；2695型高效液相色譜儀（配2489紫外檢測器）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

在銹斑蟳蒸煮液中先加入6 825 U/g堿性蛋白酶，初始水解pH值為8.45、水解時間為2.50 h，再加入3 750 U/g風味蛋白酶，初始水解pH值為6.8、水解時間為3.30 h，經(jīng)兩次分步酶解后得到酶解液。

1.3.2 游離氨基酸組成和含量測定

游離氨基酸組成和含量參考王虎虎等[5]的方法測定并稍作修改。吸取1mL蒸煮液或酶解液，加入2mL3%的磺基水楊酸溶液，充分混勻后沉淀2 h，在10 000×g下離心15 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾，采用氨基酸自動分析儀測定游離氨基酸組成和含量[6]。

1.3.3 呈味核苷酸含量測定

呈味核苷酸含量測定參考Yokoyama等[7]和Chen等[8]的方法并作適當調(diào)整。吸取5mL酶解液，用1.0mol/L HCl或1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.5。靜置30 min后移入50 mL容量瓶中，搖勻過0.45 μm濾膜裝入進樣瓶中。以上所有操作均在0℃～4℃下進行。

高效液相色譜條件：色譜柱為Waters X Bridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為磷酸鹽緩沖溶液（0.05 mol/L的 KH2PO4與 K2HPO4按 1∶1體積比混合）；流動相B為甲醇溶液；洗脫方式為等梯度洗脫；流速為0.8 mL/min，柱溫為23℃，檢測波長254 nm。

采用高效液相色譜法測定酶解液中5'-腺苷酸（5'-adenosine monophosphate，5'-AMP）、5'-肌苷酸（5'-inosine monophosphate，5'-IMP）、5'-鳥苷酸（5'-guanosine monophosphate，5'-GMP）、次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）及次黃嘌呤核苷（inosine，HxR）的含量。

1.3.4 揮發(fā)性風味物質(zhì)測定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析檢測樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)組成和含量。頂空固相微萃取條件：選擇 50/30 μm PDMS/CAR/DVB（2 cm）萃取纖維頭，設定萃取裝置溫度為70℃，頂空萃取50 min，250℃解吸5 min，進樣分析；色譜和質(zhì)譜條件參考陶美潔等[9]的方法。

1.3.5 滋味強度值（taste activity value，TAV）

滋味強度值可以表示一種物質(zhì)對該物質(zhì)呈味特征的貢獻度[10]，游離氨基酸的TAV按下式計算。

式中：C為滋味物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/100 mL；T為滋味物質(zhì)的呈味閾值，mg/100 mL。

1.3.6 鮮味評價方法——等效鮮味濃度（equivalent umami concentration，EUC）值

等效鮮味濃度[11]表示鮮味氨基酸與呈味核苷酸混合物協(xié)同作用所產(chǎn)生的鮮味強度相當于谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）的量，EUC值按下式計算。

式中：ai為鮮味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）含量，g/100 mL；bi為鮮味氨基酸相對于谷氨酸鈉的相對鮮度系數(shù)；aj為呈味核苷酸含量，g/100 mL；bj為呈味核苷酸相對于IMP的相對鮮度系數(shù)；1 218為基于濃度的協(xié)同作用系數(shù)，g/100 mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件繪圖，采用DPS 9.50軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，差異性分析采用單因素方差分析方法（P＜0.05為差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸組成及營養(yǎng)評價

銹斑蟳蒸煮液和酶解液中氨基酸組成、含量及TAV見表1，必需氨基酸組成及分析見表2。

表1 蒸煮液和酶解液中氨基酸組成、含量及TAVTable 1 Composition，content，and TAV of amino acid in cooking liquid and hydrolysis liquid

表2 蒸煮液和酶解液中必需氨基酸組成Table 2 Essential amino acid composition in cooking liquid and hydrolysis liquid

由表1和表2可知，蒸煮液和酶解液中均檢測出16種氨基酸，在蒸煮液中甘氨酸含量最高，酶解液中丙氨酸含量最高。經(jīng)酶解后，總氨基酸含量由1 582.76 mg/100 mL增加到2 704.42 mg/100 mL，提高了70.9%，其中天冬氨酸和絲氨酸的增幅最為明顯，分別提高了272%和377.9%，說明利用蛋白酶水解能使大分子蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸等產(chǎn)物，提高酶解液滋味物質(zhì)含量。經(jīng)計算，蒸煮液中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的38.5%，高于聯(lián)合國糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織（World Health Organization and Food and Agriculture Organization of the United Nations，WHO/FAO）提出的標準蛋白必需氨基酸含量（35.00%），低于全雞蛋標準（49.70%），而酶解液中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的46.1%，均高于這兩個標準。

氨基酸評分（amino acid score，AAS）和化學評分（chemical score，CS）作為營養(yǎng)學中對蛋白質(zhì)營養(yǎng)進行評價的重要指標，常被用作判斷該食物營養(yǎng)價值的高低[13]。表3為蒸煮液和酶解液的氨基酸評分和化學評分。

表3 蒸煮液和酶解液氨基酸評分和化學評分Table 3 Amino acid scores and chemical scores in cooking liquid and hydrolysis liquid

表3中兩種評價標準結(jié)果顯示，蒸煮液中第一限制氨基酸為異亮氨酸，酶解液中第一限制氨基酸為甲硫氨酸+半胱氨酸。以AAS為評價標準，蒸煮液和酶解液的AAS分別為95.25和95.43，以CS為評價標準，蒸煮液和酶解液的CS分別為57.73和60.73，因此酶解液的AAS和CS評分均略高于蒸煮液。必需氨基酸指數(shù)（essential amino acids index，EAAI）是評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的常用指標之一，數(shù)值越高說明該蛋白質(zhì)越接近人體營養(yǎng)所需，蛋白質(zhì)質(zhì)量和利用率越高，由表3可知，酶解液的 EAAI（103.07）遠高于蒸煮液（87.95），依據(jù)EAAI評價標準[14]，酶解液為優(yōu)質(zhì)蛋白源，蒸煮液為良好蛋白源。綜上所述，酶解液中氨基酸組成更為平衡，具有更高的營養(yǎng)價值。

2.2 鮮味氨基酸含量及TAV

鮮味氨基酸含量對銹斑蟳蒸煮液和酶解液滋味具有重要作用，由表1可知，4種呈味氨基酸在蒸煮液中含量為560.51 mg/100 mL，經(jīng)分步酶解后在酶解液中含量為808.47 mg/100 mL。呈味氨基酸在酶解液中占總氨基酸含量的29.9%，其中呈鮮味特征的谷氨酸和天冬氨酸[15]總和占總氨基酸含量的10.8%。酶解液中游離氨基酸組成均衡，品質(zhì)優(yōu)良，呈味氨基酸含量突出，適合作為風味前體物質(zhì)生產(chǎn)調(diào)味料。

TAV作為評價滋味物質(zhì)對食物滋味貢獻大小的指標，已廣泛應用于各類食物的滋味物質(zhì)的研究[16]。在蒸煮液中有9種氨基酸的TAV>1，酶解液中有11種氨基酸的TAV>1，其中TAV最高的氨基酸均為谷氨酸，谷氨酸的TAV在蒸煮液中為3.95，在酶解液中為7.68。谷氨酸和呈味核苷酸之間具有協(xié)同增鮮的作用，進一步說明銹斑蟳蒸煮液滋味鮮美，經(jīng)酶解后釋放出更多的鮮味物質(zhì)，是開發(fā)調(diào)味品的理想基料。

2.3 呈味核苷酸含量及TAV

在核糖部分的5位碳上形成磷酸脂的核苷酸才呈現(xiàn)鮮味[17]，5'-AMP、5'-IMP和5'-GMP是自然界中存在的幾種單核苷酸，具有強烈的呈味作用。其中對滋味有較大貢獻的是5'-IMP與5'-AMP，5'-IMP是鮮味核苷酸，具有強烈鮮味，低濃度的5'-IMP對5'-AMP呈現(xiàn)的鮮味和甜味都有增效作用，同時對咸、酸、苦味及腥、焦味有抑制作用，低濃度的5'-AMP可以產(chǎn)生適當?shù)奶鹞禰18]，蒸煮液和酶解液中呈味核苷酸含量及其TAV見表4。

表4 蒸煮液和酶解液中5′-核苷酸組成及TAVTable 4 Composition and TAV of 5′-nucleotides in cooking liquid and hydrolysis liquid

由表4可知，雖然在蒸煮液中5'-AMP含量高于5'-IMP，而在酶解液中5'-IMP含量要高于5'-AMP，總體上看5'-AMP和5'-IMP的TAV均較低，只有酶解液中5'-IMP的TAV接近1，說明從TAV角度呈味核苷酸對滋味貢獻不大。然而，核苷酸類物質(zhì)是一類呈味活性物質(zhì)，可以與谷氨酸、天冬氨酸等鮮味氨基酸協(xié)同增鮮，通過等效鮮味強度體現(xiàn)對總體風味的提升作用。

2.4 EUC評價

核苷酸類物質(zhì)可以與谷氨酸起到協(xié)同增鮮的作用，Maga[19]研究發(fā)現(xiàn)當谷氨酸與IMP以相同比例混合，其味覺鮮味強度是單獨使用谷氨酸的7倍。鮮味氨基酸和呈味核苷酸之間存在協(xié)同增效作用，采用EUC值直觀表征鮮味氨基酸與呈味核苷酸混合物協(xié)同作用所產(chǎn)生的鮮味強度，將蒸煮液和酶解液的鮮味氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）和5'-核苷酸（5'-GMP、5'-IMP、5'-AMP）的含量代入1.3.6的公式，EUC值計算結(jié)果如表5所示。

表5 蒸煮液和酶解液的EUC值Table 5 EUC value in cooking liquid and hydrolysis liquid

由表5可知，EUC值從酶解前的3.90gMSG/100mL提升至酶解后的8.78 g MSG/100 mL，經(jīng)分步酶解的風味前體物質(zhì)的等效鮮味值是蒸煮液的2倍以上，此酶解方法可有效提高酶解產(chǎn)物的滋味。

2.5 揮發(fā)性風味物質(zhì)種類及含量

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析檢測得到的各揮發(fā)性風味物質(zhì)種類及其相對含量見表6和表7。

表6 蒸煮液中揮發(fā)性風味物質(zhì)組成Table 6 Composition of volatile flavor substances in cooking liquid

表7 酶解液中揮發(fā)性風味物質(zhì)組成Table 7 Composition of volatile flavor substances in hydrolysis liquid

由表6可知，在蒸煮液中發(fā)現(xiàn)16種揮發(fā)性風味物質(zhì)，主要為吡嗪類，占總揮發(fā)物質(zhì)含量的85.51%，還有少量醇類和酸類有效成分。吡嗪類化合物是典型的美拉德反應產(chǎn)物[20]，可賦予食品烤香或堅果香等香味。蒸煮液中檢測到含量最高的2，5-二甲基吡嗪具有烤香、堅果香或肉香的風味特征[21]，是蒸煮液主要的風味物質(zhì)。由表7可知，在酶解液中發(fā)現(xiàn)30種揮發(fā)性風味物質(zhì)，主要為醇類和醛類，占總揮發(fā)物質(zhì)含量的99.14%。醛類物質(zhì)呈味閾值較低，是構(gòu)成肉香風味的重要物質(zhì)[22]，經(jīng)酶解后醛類化合物中含量最高的是對甲基苯甲醛，具有肉桂香料的特質(zhì)；醇類化合物對于香氣的形成具有重要作用，特別是對海鮮類風味基料氣味的形成[3]，醇類化合物中含量最高的芳樟醇，具有清甜果香[23]。

比較兩種樣品的揮發(fā)性風味物質(zhì)整體構(gòu)成，蒸煮液經(jīng)酶解后吡嗪類化合物大量降低而烴類物質(zhì)增加，烴類化合物通常具有清香和甜香的風味，對整體風味有一定的貢獻。醇類和醛類化合物種類和含量明顯提高，是海鮮香氣的重要組成。盡管蒸煮液中含有大量吡嗪類化合物，但風味單一，經(jīng)酶解后各類風味物質(zhì)含量提高，使酶解液中香氣更加濃郁，具有更強烈的海鮮香。此外，酶解液中還含有微量的角鯊烯，該化合物是一種多不飽和烯類物質(zhì)，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、增強機體免疫能力等生理功能[24]。

3 結(jié)論

銹斑蟳蒸煮液和酶解液中均檢測出16種氨基酸，其中蒸煮液中必需氨基酸占比38.5%，酶解液中必需氨基酸占比46.1%。對比EAAI、AAS和CS 3個評價指標的得分值，酶解液均高于蒸煮液，說明其氨基酸組成更為平衡，具有更高的營養(yǎng)價值。鮮味氨基酸在蒸煮液中含量為560.51 mg/100 mL，經(jīng)分步酶解后在酶解液中達到808.47 mg/100 mL，其中呈鮮味特征的谷氨酸和天冬氨酸總和占酶解液總氨基酸含量的10.8%。谷氨酸TAV在蒸煮液中為3.95，在酶解液中提高到7.68，酶解液的鮮味氨基酸含量突出，進一步說明其適合作為風味前體物質(zhì)生產(chǎn)調(diào)味料。研究還發(fā)現(xiàn)呈味核苷酸的TAV普遍較低，從該角度說明呈味核苷酸對滋味貢獻不大，然而核苷酸類物質(zhì)可以與谷氨酸起到協(xié)同增鮮的作用，使酶解液的EUC值達到8.78 g MSG/100 mL。通過對蒸煮液和酶解液中揮發(fā)性風味物質(zhì)定性和定量分析，在蒸煮液中發(fā)現(xiàn)16種揮發(fā)性風味成分，主要為吡嗪類，表明銹斑蟳在加熱蒸煮過程中發(fā)生了美拉德反應，生成大量產(chǎn)物。酶解液中發(fā)現(xiàn)30種揮發(fā)性風味成分，主要為醇類和醛類物質(zhì)，醇類化合物中含量最高的芳樟醇具有清甜果香，醛類化合物中含量最高的是對甲基苯甲醛，有肉桂香料的特質(zhì)，是酶解液的主要特征性揮發(fā)物質(zhì)。經(jīng)試驗綜合評價，銹斑蟳蒸煮液經(jīng)過分步酶解后，其酶解產(chǎn)物具有更高的營養(yǎng)價值和風味品質(zhì)，更適合作為風味基料復配到調(diào)味品中。