白冰瑤，李泉岑，馬欣悅，吳一凡，喬婉怡，王馥葉，張春蘭*

（1.塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科棗屬植物，在我國新疆、陜西、山西、河北等北方地區(qū)大量種植[1]。紅棗可用于日常直接食用或泡酒、熬粥，在食品工業(yè)中一般用于紅棗飲品的制作，在烘焙類食品中也會添加紅棗[2]。紅棗中富含多糖[3]、皂苷、維生素、多酚[4]、脂肪酸[5]等營養(yǎng)物質(zhì)，其中紅棗多糖是紅棗最重要的活性成分之一[6]。紅棗多糖具有治療糖尿病、抗炎[7]、增強(qiáng)免疫力、抗癌[8]、抗過敏[9]、抗腫瘤活性[10]等生理功能，同時還表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。

食品加工過程中，紅棗多糖的損失成為需要解決的重要問題。目前在食品工業(yè)中提取多糖的方法大多為傳統(tǒng)溶劑提取或高溫水提法提取。超聲輔助提取多糖最為普遍，此法具有耗時短、操作簡單、提取率高的優(yōu)點(diǎn)[11-14]，而高溫水提法由于耗時長、藥品用量高且提取率低[15]，已經(jīng)不能滿足市場需要。低共熔溶劑是綠色溶劑，其污染小、藥品易獲得、毒性小、價格低廉且與其他有機(jī)溶劑相比，有更高的溶解性和擴(kuò)散性[16-19]，因此采用超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗多糖符合日后食品工業(yè)發(fā)展需求。在研究多糖提取過程中，由于不同低共熔溶劑體系的黏稠度及擴(kuò)散性和對不同品種多糖的溶解能力不同[20-22]，因此需要對低共熔溶劑體系進(jìn)行探究。本文以新疆阿克蘇紅棗作為研究對象，選用超聲輔助低共熔溶劑，通過研究不同低共熔溶劑體系、超聲溫度、超聲時間、料液比以及含水率對紅棗多糖提取效果影響的規(guī)律，確定最優(yōu)的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿克蘇紅棗：市售。

無水乙醇（分析純）：天津北聯(lián)精細(xì)化工有限公司；硫酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；苯酚（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；葡萄糖（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；尿素（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸（分析純）：天津市化學(xué)試劑三廠；氯化膽堿、乳酸、1，4-丁二醇、脯氨酸、蘋果酸（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（LE203E/02）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超級恒溫水浴鍋（HH-501）：江蘇金怡儀器科技有限公司；超聲清洗機(jī)（JP-060S）：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；真空泵（SHZ-DⅢ）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-3000A）：上海亞榮生化儀器廠；高速臺式離心機(jī)（TGL-20B）：上海安亭科學(xué)儀器廠；渦旋混勻器（VM-02U）：美國精騏有限公司；分光光度計(jì)（UV-5500PC）：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

紅棗清洗、去核和切片，放入60℃烘箱烘干，烘干后用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩制備紅棗粉。

1.3.2 低共熔溶劑的制備

按照司悅悅[23]的方法，將氯化膽堿分別與乳酸、1，4-丁二醇、尿素、檸檬酸、脯氨酸和蘋果酸按比例混合，在85℃條件下水浴攪拌至形成清澈透明的溶液。

1.3.3 總多糖提取工藝以及低共熔溶劑體系的確定

按照倪玉嬌等[24]的方法并加以改進(jìn)，稱取1.00 g紅棗粉于離心管中，按照料液比1∶20（g/mL），含水率為20%加入低共熔溶劑16 mL，蒸餾水4 mL混合均勻，40℃超聲30 min，4 000 r/min條件下離心20 min，取上清液，加入4倍體積無水乙醇于4℃環(huán)境中醇沉過夜，4 000 r/min離心20 min收集沉淀，用無水乙醇洗滌沉淀3次后，繼續(xù)4 000 r/min離心10 min收集沉淀，沉淀物加水溶解定容至100 mL，測量其多糖提取率。低共熔溶劑的種類及比例見表1。

表1 低共熔溶劑的種類及比例Table 1 Types and proportions of low eutectic solvents

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 超聲溫度對紅棗多糖提取率的影響

在超聲時間 30 min，料液比 1∶20（g/mL），含水量20%的條件下，探究超聲溫度分別為20、30、40、50、60℃對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.4.2 超聲時間對紅棗多糖提取率的影響

在超聲溫度 40 ℃，料液比 1∶20（g/mL），含水量20%的條件下，探究超聲時間分別為10、20、30、40、50 min對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.4.3 料液比對紅棗多糖提取率的影響

在超聲溫度40℃，超聲時間為30 min，含水量20%的條件下，探究料液比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30（g/mL）對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.4.4 含水量對紅棗多糖提取率的影響

在超聲溫度40℃，超聲時間為30 min，料液比為1∶10（g/mL）的條件下，探究含水量分別為 5%、10%、20%、30%、40%對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取超聲溫度、超聲時間、料液比、含水量4個因素，紅棗中的多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 2 Response surface experimental factor level of extraction rate of jujube polysaccharide

1.3.6 多糖提取率的計(jì)算

1.3.6.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

根據(jù)郭毓菲等[25]的方法，采用苯酚-硫酸法測定多糖提取率，將葡萄糖放置于105℃烘箱中烘至恒重后，準(zhǔn)確稱取50 mg，配制成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取不同體積1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液配置成為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.250、0.500 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入1 mL 6%苯酚和5 mL濃硫酸，渦旋混勻，90℃煮沸20 min后，于490 nm處測量其吸光值。得線性回歸方程為y=9.851 5x-0.018 4，R2=0.998 2，x為葡萄糖濃度，mg/mL；y 為對應(yīng)吸光值，根據(jù)回歸方程確定紅棗中多糖濃度。

1.3.6.2 多糖提取率的測定方法及計(jì)算

吸取紅棗粗多糖溶液1mL，稀釋到一定體積。在稀釋后的溶液中吸取1mL，加入1mL6%苯酚和5mL濃硫酸，使用渦旋混勻器進(jìn)行渦旋，避光保存20min后，于490 nm處測量其吸光值。多糖提取率計(jì)算公式如下。

式中：C為回歸方程計(jì)算得到紅棗多糖的濃度，mg/mL；V為定容的體積，mL；N為稀釋的倍數(shù)；M為原材料的質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)測定3次，繪圖采用origin 2019b軟件，響應(yīng)面分析軟件為Design-Expert 8.0.6，采用IBM SPSS Statistics26進(jìn)行顯著性分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)低共熔溶劑體系的確定

低共熔溶劑種類對紅棗多糖提取率的影響見圖1。

圖1 低共熔溶劑種類對紅棗多糖提取率的影響Fig.1 Effect types of deep eutectic solvents on extraction rate of jujube polysaccharide

由圖1可知，不同低共熔溶劑體系中黏稠度、擴(kuò)散性、電極性以及對多糖的氫鍵作用力不同，導(dǎo)致能溶解到低共熔溶劑中的紅棗多糖提取率不同[26]。通過比較不同低共熔溶劑種類和比例發(fā)現(xiàn)，控制其他條件不變，當(dāng)氯化膽堿與尿素摩爾比為1∶2時，從紅棗粉中提取的多糖提取率最高，可能是氯化膽堿與尿素的混合體系黏稠度較低和擴(kuò)散性較強(qiáng)，使多糖溶解率升高。因此，確定摩爾比1∶2的氯化膽堿與尿素為提取紅棗多糖的低共熔溶劑體系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲溫度對紅棗多糖提取率的影響

超聲溫度對紅棗多糖提取率影響結(jié)果見圖2。

圖2 超聲溫度對紅棗多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of jujube polysaccharide

紅棗多糖提取率隨著超聲溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，并在40℃時多糖提取率最高。這是因?yàn)樵谖催_(dá)到峰值時，溫度升高，使其多糖溶解速度加快；當(dāng)溫度高于40℃后，隨著溫度繼續(xù)增大可能會有其他物質(zhì)析出，導(dǎo)致溶液中的黏稠度增加，抑制多糖的溶解，導(dǎo)致多糖提取率降低[27]。因此，紅棗多糖最優(yōu)提取溫度為40℃。

2.2.2 超聲時間對紅棗多糖提取率的影響

超聲時間對紅棗多糖提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時間對紅棗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of jujube polysaccharide

由圖3可知，紅棗多糖提取率隨著超聲時間的增加呈先上升后下降的趨勢，并在30 min時到達(dá)峰值。這主要是由于在30 min之前紅棗多糖未能被溶劑充分溶解，導(dǎo)致多糖提取率較低；30 min后，由于過度超聲可能引起部分多糖降解，糖苷鍵發(fā)生斷裂，細(xì)胞破碎，結(jié)構(gòu)破壞，引起多糖提取率減少[28]。因此，紅棗多糖提取的最優(yōu)超聲時間為30 min。

2.2.3 料液比對紅棗多糖提取率的影響

料液比對紅棗多糖提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 料液比對紅棗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of jujube polysaccharide

如圖4所示，隨著溶劑用量的不斷增加，紅棗多糖提取率先上升后下降，在料液比為1∶10（g/mL）時取得最大值，且料液比在 1∶5（g/mL）～1∶20（g/mL）時紅棗多糖提取率變化較小。原因是溶劑用量較小時低共熔溶劑體系達(dá)到飽和，無法溶解更多的紅棗多糖；當(dāng)溶劑用量較大時紅棗粉與溶劑體系的接觸面積不斷增大，溶解出其他雜質(zhì)，導(dǎo)致多糖溶解被抑制[29]。因此，選擇1∶10（g/mL）為多糖提取的最優(yōu)料液比。

2.2.4 含水量對紅棗多糖提取率的影響

含水量對紅棗多糖提取率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 含水量對紅棗多糖提取率的影響Fig.5 Effect of water content on extraction rate of jujube polysaccharide

如圖5所示，紅棗多糖提取率隨著含水量增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在含水量為20%時達(dá)到最大值。原因可能是含水量太低時，溶液體系太黏稠，導(dǎo)致多糖無法充分析出[30]；當(dāng)含水量大于20%后，可能因?yàn)楹侍撸谷芤后w系中出現(xiàn)了其他的親水混合物，導(dǎo)致低共熔溶劑與多糖之間的作用力下降，引發(fā)多糖提取率減少[31]。因此，紅棗多糖提取工藝的最優(yōu)含水量確定為20%。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取紅棗多糖工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以紅棗多糖提取率為評價指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

表3 紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface design and results of jujube polysaccharide extraction rate

續(xù)表3 紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 Response surface design and results of jujube polysaccharide extraction rate

2.3.2 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析

通過回歸分析，得出紅棗多糖提取率的回歸方程：紅棗多糖提取率=8.14-0.30A+0.41B-0.16C+0.60D-0.11AB-0.68AC-0.54AD+0.23BC-0.47BD-0.025CD-2.48A2-1.63B2-1.19C2-1.62D2。

方差分析結(jié)果見表4。

表4 紅棗多糖提取率響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiment regression model for jujube polysaccharide extraction rate

根據(jù)表4可知 B、D、A2、B2、C2、D2、AC 對紅棗多糖提取率影響極顯著（P＜0.01）；A、AD對紅棗多糖提取率影響顯著（P＜0.05）；C、AB、BC、BD、CD 對紅棗多糖提取率影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值可知，紅棗多糖提取率的影響因素從大到小依次：含水量＞超聲時間＞超聲溫度＞料液比。由模型P值＜0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.126 9，不顯著；R2以及RAdj2分別為0.960 4和0.920 8，可知該模型擬合度較好。由此可知，該模型可以較真實(shí)的反應(yīng)紅棗中多糖提取率的提取情況。

2.3.3 交互作用分析

各因素交互作用影響結(jié)果見圖6。

圖6 各因素交互作用對紅棗多糖提取率的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on extraction rate of jujube polysaccharide

通過等高線圖和3D圖可以直觀發(fā)現(xiàn)各因素交互作用對紅棗多糖提取率的影響。由圖6中的等高線可知，超聲溫度與料液比和含水量之間所呈現(xiàn)的形狀為橢圓形，且等高線較密集；且相對應(yīng)的3D圖坡度陡峭，表明超聲溫度與料液比和含水量之間的交互作用對紅棗中的多糖提取率影響較大，與方差分析表中的結(jié)論相符合。

2.3.4 最優(yōu)工藝條件確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過響應(yīng)面軟件分析得出，紅棗多糖最優(yōu)的提取條件為超聲溫度39.21℃，超聲時間31.00 min，料液比1∶9.82（g/mL），含水量 21.84%，在此條件下，預(yù)測的紅棗多糖提取率為8.23%?？紤]實(shí)際情況，調(diào)整提取工藝為超聲溫度 40 ℃，超聲時間 30 min，料液比 1∶10（g/mL），含水量為20%，在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出紅棗多糖提取率為（8.33±0.26）%，與模型中預(yù)期的結(jié)果差異不顯著，表明該優(yōu)化結(jié)果可靠，可以用于提取紅棗多糖的工藝。

3 結(jié)論

在快速發(fā)展的食品工業(yè)中，傳統(tǒng)溶劑提取紅棗多糖已不能滿足市場需要。由于超聲輔助低共熔溶劑提取多糖具有耗時短、提取簡單、提取率高的優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)采用超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗多糖，以多糖提取率為評價指標(biāo)，確定了以氯化膽堿與尿素摩爾比1∶2為低共熔溶劑體系的優(yōu)化工藝，通過響應(yīng)面法確定了最優(yōu)提取工藝為超聲溫度40℃，超聲時間30 min，料液比1∶10（g/mL），含水量20%；在此優(yōu)化工藝條件下，多糖提取率高達(dá)8.33%。該工藝為日后食品工業(yè)中紅棗多糖的提取奠定了理論基礎(chǔ)。