王夢琪，陳文婷，程金生，敬思群*，鐘瑞敏，李發(fā)利，于白音

（1.韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844006；3.韶關(guān)市曲江區(qū)竹園火山粉葛專業(yè)合作社，廣東 韶關(guān) 512005）

葛根（Puerariae Lobatae Radix，RLP）為豆科植物的干燥根[1]，分為粉葛和野葛根兩大類。葛根資源十分豐富，分布極其廣泛，在我國它主要分布在溫暖潮濕、土質(zhì)深厚、富含砂質(zhì)土壤的江南地域[2]。葛根是一種藥食同源的植物，始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有較高的營養(yǎng)保健功效和藥用價值。葛根性甘、辛、涼，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉之功[3]。其主要的活性成分是葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類化合物[4]，葛根對心腦血管、免疫系統(tǒng)疾病有很好的治療效果[5]。葛根茶作為一項新興的葛根制品具有很大的市場潛力[6-8]。黃維安等[9]以菊苣、葛根、甜茶、五指毛桃、橘皮等藥食同源的中藥材為原料，經(jīng)清洗、干燥、粉碎、包裝等工藝制成菊苣葛根袋泡茶；雷成群等[10]經(jīng)發(fā)酵除淀粉、烘炒提香、烘干等工藝制得粉狀葛根茶；王潤東等[11]利用提取完淀粉后的葛根纖維渣，采用固定化細胞技術(shù)制得紅茶菌發(fā)酵葛根茶飲料。野葛根直接沖泡時，具有濃郁的中藥氣味以及苦味，飲后口感粗糙苦澀。通過預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，搭配枸杞、杭白菊沖泡后不僅能凸顯野葛根較濃郁的特征風味，還保留了杭白菊、枸杞子的酸甜清香的口感。目前，關(guān)于葛根茶抗氧化作用研究鮮見報道。

本研究以異黃酮含量、感官評價為考察指標，研究配料比（葛根∶枸杞子∶杭白菊）、沖泡時間、沖泡溫度和用水量對葛根袋泡茶（Puerariae Lobatae Radix tea bag，PLRTB）品質(zhì)的影響，采用綜合評分法，通過均勻設(shè)計優(yōu)化葛根袋泡茶配方和沏茶工藝參數(shù)，同時分析了葛根袋泡茶的抗氧化性及揮發(fā)性成分，為葛根袋泡茶產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

野葛根粒：韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院功能食品研究室自制。將野葛根粒清理除雜，用中藥鍘刀切成1 cm×0.5 cm小段，過14目篩除去篩下物，在60℃烘箱烘干7 h～8 h，真空干燥器中保存。野葛根：韶關(guān)市曲江區(qū)大塘鎮(zhèn)竹園火山粉葛專業(yè)合作社；杭白菊（食品級）：寧國市藝然食品商貿(mào)有限公司；枸杞子（食品級）：寧夏果果老爹食品有限公司。

葛根素（色譜純，純度≥99.9%）：上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸（VC）（優(yōu)級純，純度≥99.7%）：西隴科學(xué)股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純，純度＞97%）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二 胺 鹽 [2，2'-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]（分析純，純度＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀（K2S2O8）、氯化鉀、鐵氰化鉀[K3Fe（CN）6]（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BSM-220.4分析天平：上海卓精電子科技有限公司；KD0281中藥鍘刀：廣東膳道廚具有限責任公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州越新儀器制造有限公司；DHG-9146電熱恒溫鼓風干燥箱：金壇市大地自動化儀器廠；UV-2600紫外分光光度計、GCMS-QP2010氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；TD-5Z臺式低速多管架離心機：四川蜀科儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 葛根袋泡茶制備工藝單因素試驗

1.2.1.1 原輔料配方單因素試驗

以野葛根為原料，枸杞子、杭白菊為輔料，按照以下配比制成袋泡茶（總質(zhì)量為2.00 g），以感官評分、異黃酮含量為考察指標，采用綜合評分法確定最適的原輔料配方。原輔料比是葛根∶輔料（杭白菊∶枸杞子）（g/g），輔料比為杭白菊∶枸杞子（g/g）。

1）原輔料比對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響：在輔料比為1∶1（g/g）時，用 100℃100 mL 水沖泡 8 min，原輔料比分別為 1∶1、2∶1、3∶1、3∶2、4∶1（g/g），確定最適原輔料配比。

2）輔料比（杭白菊∶枸杞子）對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響：在原輔料比為 2∶1（g/g）時，用 100 ℃ 100 mL 水沖泡 8 min，輔料比（杭白菊∶枸杞子）分別為 1∶6、2∶5、1∶1、5∶2、6∶1（g/g），確定最適輔料配比。

1.2.1.2 葛根袋泡茶沏茶工藝單因素試驗

以野葛根為原料，枸杞子、杭白菊花為輔料，按照原輔料比為 2∶1（g/g），輔料比為 1∶1（g/g）的配比制成袋泡茶（總重為2.00 g），以感官評分、異黃酮含量為考察指標，采用綜合評分法確定最適的單因素水平。

1）沖泡時間對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響：用100℃100 mL 水進行沖泡，分別沖泡 4、6、8、10、12 min，確定最適沖泡時間。

2）用水量對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響：用100℃的水沖泡 10 min，分別加入 50、100、150、200、250 mL 水進行沖泡，確定最適用水量。

3）沖泡溫度對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響：用100 mL水沖泡 10 min，分別用 40、55、70、85、100 ℃進行沖泡，確定最適沖泡溫度。

1.2.2 葛根袋泡茶制備工藝均勻設(shè)計試驗

通過單因素試驗，得最適配比及其沏茶工藝后，為優(yōu)化袋泡茶方案，選取5個試驗因素：原輔料比（X1）、輔料比（X2）、沖泡時間（X3）、沖泡溫度（X4）、用水量（X5），每個因素設(shè)置 5 個水平，以異黃酮含量（W1）和感官評分（W2）為試驗指標，綜合評分使用因變量W表示，其綜合評分越高，各試驗因素組合效果越好。根據(jù)均勻設(shè)計基本原理，采用均勻設(shè)計U10（1010）優(yōu)化葛根袋泡茶配方，設(shè)計表見表1。

表1 U10（1010）均勻設(shè)計試驗因素水平Table 1Factors and levels of U10（1010）uniform design

1.2.3 葛根袋泡茶品質(zhì)的評價方法

1.2.3.1 感官評定標準

從袋泡茶的外形、湯色、香氣、滋味、葉底5方面評定袋泡茶的質(zhì)量，由8位具有一定專業(yè)知識的技術(shù)人員根據(jù)袋泡茶的感官質(zhì)量指標進行評分。參考國標GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》[12]制定評價標準，見表2。

表2 葛根袋泡茶感官評分標準Table 2 Sensory scoring criteria of PLRTB

1.2.3.2 異黃酮含量測定

異黃酮含量測定方法參考地方標準DB32/T 1277—2008《葛根中異黃酮含量的測定紫外分光光度法》[13]，稍有改動。得到吸光度與葛根素濃度的回歸方程為y=74.536x+0.011 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，在0～0.012 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)。

樣品異黃酮含量測定：移取100 μL在一定沖泡溫度、沖泡時間、用水量下制得的茶液，以70%乙醇定容到10 mL容量瓶中，于250 nm處測定樣品吸光度，以70%乙醇為參比溶液，根據(jù)標準曲線計算得出試樣中異黃酮含量。計算公式如下。

式中：C為回歸方程中求出的葛根素含量，mg/mL；V1為試樣溶液體積，mL；V2為茶湯體積，mL。

1.2.3.3 綜合評分法

本試驗以異黃酮含量、感官評分作為考察指標，采用綜合評分法可將兩者有效結(jié)合。異黃酮含量和感官評分的權(quán)重系數(shù)各為0.5。

按此方法進行加權(quán)求和，綜合評分計算公式如下。

式中：W為綜合評分；W1為異黃酮含量的數(shù)值；W1max為各組的異黃酮含量對應(yīng)的最大值；W2為感官評分。

1.2.4 體外抗氧化活性評價

1.2.4.1 樣液制備

取5袋葛根袋泡茶（每袋含葛根、枸杞子、杭白菊質(zhì)量分別為 1.33、0.40、0.27 g，內(nèi)容物共 10.00 g），搗碎，加入100mL冷凝水，65℃水浴提取5h，離心后取上清液，在0.08 MPa、80℃條件下旋蒸2 h，得濃度為0.1 g/mL的袋泡茶提取液。再將袋泡茶提取液用去離子水稀釋為 5 個梯度濃度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，備用。

1.2.4.2 抗壞血酸（VC）溶液制備

準確稱取0.25 g抗壞血酸（VC），溶解并定容于25 mL容量瓶中，制得10 mg/mL的抗壞血酸對照品溶液，再將其稀釋為 5 個梯度濃度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，備用。

1.2.4.3 抗氧化活性分析

以清除DPPH自由基能力、清除ABTS+自由基能力、總抗氧化能力為體外抗氧化能力評價指標，以抗壞血酸為對照。以IC50值表示清除DPPH自由基能力、清除ABTS+自由基能力，IC50值表示樣品提取液抑制DPPH（或ABTS+）自由基的吸光度為50%時提取物的濃度，IC50值越小，表示抗氧化能力越強。制備葛根袋泡茶提取液，以它們的抗氧化性來反映袋泡茶的抗氧化活性。

DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及總抗氧化能力的測定參考周揚等[14]的方法。

DPPH自由基清除能力測定采用紫外分光光度計于波長517 nm處分別測定3 mL蒸餾水與3 mL DPPH乙醇混合溶液、3 mL樣品液與3 mL DPPH乙醇混合液、3 mL樣品液與3 mL無水乙醇混合液的吸光度A0、A1、A2。以抗壞血酸為陽性對照組。DPPH自由基清除率計算公式：DPPH 自由基清除率/%=[A0-（A1-A2）/A0]×100。

ABTS+自由基清除能力是采用紫外分光光度計于波長734 nm處分別測定0.2 mL蒸餾水與4 mL ABTS溶液、0.2 mL樣品液與4 mL ABTS溶液、0.2 mL樣品液與4 mL蒸餾水混合溶液反應(yīng)后的吸光度A0、A1、A2。ABTS+自由基的清除率計算公式：清除率/%=[A0-（A1-A2）/A0]×100。

總抗氧化能力的測定：取1 mL樣品液與2.5 mL磷酸鹽緩沖液（pH6.6）、2.5 mL1%鐵氰化鉀溶液混勻，50℃水浴反應(yīng)20 min，隨后加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，吸取2.5 mL，加入蒸餾水和0.1%FeCl3溶液各2.5 mL，混勻，室溫下靜置10 min，700 nm處測定吸光度A。以蒸餾水作空白對照測吸光度A0，以抗壞血酸為陽性對照?？偪寡趸芰Γ╓A）計算公式：WA=A-A0。

1.2.5 葛根袋泡茶揮發(fā)性成分分析

采用頂空-固態(tài)微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（headspace solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）分析袋泡茶風味成分，參照雷丹等[15]的方法，稍有修改。

樣品處理：稱取葛根袋泡茶樣品2 g，制得茶湯，準確吸?。?.5±0.01）mL茶湯于15 mL頂空瓶中，置于65℃恒溫水浴中平衡10 min，使葛根茶樣品揮發(fā)性物質(zhì)充分釋放；用DVB-CAR-PDMS萃取頭頂空萃取40 min（萃取前于250℃活化15 min），然后置于250℃進樣口解吸5 min。

氣相色譜-質(zhì)譜分析條件：分流比1∶1；載氣為高純氦氣；流速1.0 mL/min；進樣口溫度250℃。

氣相色譜（gas chromatography，GC）升溫程序：起始溫度40℃，保持時間2 min，以3℃/min的速率升溫至120℃保持2 min，再以10℃/min的速率升溫至230℃，保持5 min。

質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）條件：電子電離（electron ionization，EI）源，離子源溫度 230 ℃，電子能力 70 eV，接口溫度250℃，掃描范圍40.00 amu～500.00 amu。根據(jù)得到的總離子流圖譜中各色譜峰的質(zhì)譜信息，與質(zhì)譜庫進行對比，確定各個色譜峰對應(yīng)的物質(zhì)。各色譜峰面積與總峰面積之比為各組分的相對含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗重復(fù)3次，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SPSS 22.0軟件和Microsoft office Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用Prism 6.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根袋泡茶配方單因素試驗結(jié)果

原輔料比和輔料比對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響見圖1、圖2。

圖1 原輔料比對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of raw material-to-auxiliary material ratio on quality of PLRTB

圖2 輔料比對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of chrysanthemum-to-wolfberry fruit ratio on quality of PLRTB

由圖1可知，原輔料比為3∶2（g/g）時感官評分達到最高值，原輔料比為2∶1（g/g）時異黃酮含量、綜合評分最高，綜合考慮確定最適原輔料比為2∶1（g/g）。

由圖2可知，輔料比為2∶5時異黃酮含量最高；輔料比為1∶1（g/g）時感官評分、綜合評分最高，綜合考慮確定最適輔料比為 1∶1（g/g）。

2.2 葛根袋泡茶沏茶工藝單因素試驗結(jié)果

沖泡時間、用水量、沖泡溫度對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響見圖3～圖5。

圖3 沖泡時間對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of brewing time on quality of PLRTB

圖4 用水量對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of water amount on quality of PLRTB

圖5 沖泡溫度對葛根袋泡茶品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of brewing temperature on quality of PLRTB

由圖3可知，葛根袋泡茶的感官評分、綜合評分在沖泡時間為8 min時達到最高值，之后隨沖泡時間的延長感官評分下降，綜合評分基本不變，異黃酮含量持續(xù)升高，綜合考慮確定最適沖泡時間為10 min。

由圖4可知，當用水量為100 mL時感官評分最高，當用水量為50 mL時綜合評分最高，異黃酮含量隨用水量增加呈下降趨勢，用水量為50 mL時袋泡茶口感差，綜合考慮確定最佳用水量為100 mL。

由圖5可知，隨著沖泡溫度的升高，感官評分逐漸增長并在100℃時達到最高分；當沖泡溫度為55℃～70℃時，異黃酮含量急劇升高并達到頂峰，高于70℃后平緩下降；沖泡溫度為70℃綜合評分最高，綜合考慮確定最適沖泡溫度為70℃。

以上單因素試驗結(jié)果顯示，葛根袋泡茶最適配比分別為原輔料比 2∶1（g/g）、輔料比 1∶1（g/g）；最適沏茶工藝分別為沖泡時間10 min、用水量100 mL、沖泡溫度70℃。

2.3 葛根袋泡茶工藝U10（1010）均勻設(shè)計試驗結(jié)果

葛根袋泡茶工藝U10（1010）均勻設(shè)計試驗結(jié)果見表3。

表3 U10（1010）均勻設(shè)計試驗結(jié)果Table 3Results of U10（1010）uniform design test

由表3對試驗結(jié)果的直接分析，得出第8號試驗的綜合評分W最高（91.07分）。

根據(jù)均勻設(shè)計試驗結(jié)果顯示，葛根袋泡茶最佳配比分別為原輔料比 2.00∶1（g/g）、輔料比 1.50∶1（g/g）；最佳沏茶工藝分別為沖泡時間9min、料水比為1∶25（g/mL）（袋內(nèi)容物總重為2 g，用水量50 mL）、沖泡溫度65℃。在此條件下進行驗證試驗，制備的葛根袋泡茶的綜合評分為91.25分，異黃酮含量為1.03 mg/mL。

2.4 袋泡茶的體外抗氧化性及風味成分分析

2.4.1 體外抗氧化性

葛根袋泡茶體外抗氧化能力見圖6。

圖6 葛根袋泡茶體外抗氧化能力Fig.6 In vitro antioxidant capacity of PLRTB

由圖6可知，葛根袋泡茶的DPPH、ABTS+自由基清除率和總抗氧化能力皆隨濃度增加而增加，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。葛根袋泡茶提取液與抗壞血酸（VC）清除ABTS+自由基的 IC50值分別為（1.136±0.010）、（1.228±0.011）mg/mL；清除DPPH自由基的IC50值分別為（0.307±0.005）、（0.060±0.003）mg/mL；袋泡茶提取液濃度為2.5 mg/mL時，袋泡茶與抗壞血酸（VC）的總抗氧化能力（吸光度）分別為0.319、0.205，袋泡茶的總抗氧化能力強于抗壞血酸。葛根袋泡茶有較強的抗氧化能力。

2.4.2 葛根袋泡茶揮發(fā)性成分

葛根袋泡茶的GC-MS總離子流色譜圖見圖7，葛根袋泡茶的主要揮發(fā)性成分及相對含量見表4。

圖7 葛根袋泡茶的GC-MS總離子流色譜圖Fig.7 GC-MS total ion chromatogram of PLRTB

表4 葛根袋泡茶的主要揮發(fā)性成分及相對含量Table 4 Main volatile components of PLRTB and their relative content

續(xù)表4 葛根袋泡茶的主要揮發(fā)性成分及相對含量Continue table 4 Main volatile components of PLRTB and their relative content

由表4可知，葛根袋泡茶的揮發(fā)性成分有35種，含量位于前列的依次為酯類2種（27.86%）、烯烴類10種（24.6%）、醇類9種（13.99%）、酮類4種（6.01%）、其他類10種（28.17%），單體揮發(fā)性成分含量較高的分別是左旋乙酸冰片酯（16.15%）、（Z）-乙酸菊酯（11.71%）、3，3-二甲基-6-亞甲基-環(huán)己烯（8.82%）、α-泛酸酶（7.56%）、左旋龍腦（7.06%），左旋乙酸冰片酯具有森林的新鮮香氣，左旋龍腦具有清香氣，初步推測左旋乙酸冰片酯、（Z）-乙酸菊酯、左旋龍腦是葛根袋泡茶的主要特征風味成分。

3 結(jié)論

葛根袋泡茶的最優(yōu)配方和最優(yōu)沖泡參數(shù)：原輔料比（葛根∶杭白菊+枸杞子）為 2∶1（g/g），輔料比（杭白菊∶枸杞子）為 1.5∶1（g/g），沖泡時間 9 min，沖泡溫度65℃，沖泡料水比為1∶25（g/mL）。在此條件下制備的葛根袋泡茶的綜合評分為91.25分，異黃酮含量為1.03 mg/mL。葛根茶有較強的抗氧化能力。左旋乙酸冰片酯、（Z）-乙酸菊酯、左旋龍腦是葛根袋泡茶的主要特征風味成分。