劉敏，張嵐，王丹，王長文，2*

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132000；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院慢病防治科研實驗中心，吉林 吉林 132000）

世界衛(wèi)生組織最新報告指出，全球超過13%的成年人患有肥胖癥；到2030年，全球估計有30%的成年人肥胖[1]。肥胖不僅是形象問題，它已經(jīng)被定義為一種慢性疾病，其會導(dǎo)致個體易患多種疾病，例如非酒精性脂肪性肝病、血脂異常、高血壓等[2-4]。目前，通過生活方式干預(yù)和藥物治療是減肥的常見選擇，但生活方式干預(yù)易受其他因素干擾而導(dǎo)致效果一般，而藥物治療則有不可避免的副作用。因此，近年來人們致力于開發(fā)更有效的抗肥胖生物活性物質(zhì)。

紫蘇籽是紫蘇[Perilla frutescens（L.）Britt]的種子，紫蘇和紫蘇籽均被國家衛(wèi)生部列入為藥食同源名單中。研究表明，紫蘇籽中含有黃酮、多肽、多酚等多種生物活性成分，具有降血脂、提高機體抗氧化能力和提高免疫力功能的作用[5]。近年來，植物多糖因降血糖、降血脂等作用已受到人們的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，油茶籽粕多糖能夠改善高血脂小鼠脂代謝紊亂和調(diào)節(jié)腸道菌群[6]。劉子坤等[7]研究表明，紫蘇籽多糖可提高小鼠的免疫能力并抑制腫瘤細(xì)胞的生長。然而，關(guān)于紫蘇籽多糖對高脂日糧飼喂引起小鼠的脂代謝異常和氧化應(yīng)激的影響相關(guān)研究較少。因此，本研究以紫蘇籽多糖為研究對象，探討高脂飲食的小鼠日糧中補充紫蘇籽多糖的降脂和抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇籽：亳州市康本堂藥業(yè)有限公司；200只3周齡SPF級雄性昆明種健康小鼠（體質(zhì)量10 g～12 g）：吉林省實驗動物中心。紫蘇籽多糖（Perilla frutescens seeds polysaccharide，PFSP）由長春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院自制（紫蘇籽粕中紫蘇籽多糖得率為6.85%，純度＞94%）。

目的基因上下游引物：生工生物工程（上海）有限公司；植物BCA蛋白試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、SYBR Green RT-PCR試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；生化指標(biāo)、氧化還原指標(biāo)等測定使用的試劑盒：南京建成生物工程研究所，測定過程按照相應(yīng)試劑盒說明書進行操作。

1.2 儀器與設(shè)備

BLHH-6N數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋：上海森信儀器有限公司；Uvmini-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；TS-2脫色搖床：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TGL-21高速冷凍離心機：長春市智能儀器設(shè)備有限公司；ABI Life7500熒光定量PCR儀：長春市一向科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

首先將SPF級雄性昆明種健康小鼠放置在溫度為20℃～24℃和相對濕度為55%～65%飼養(yǎng)室內(nèi)，循環(huán)光照12 h。經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將150只小鼠隨機分為對照組（control group，CK 組）、高脂日糧組（high-fat diet group，HF組）、低劑量紫蘇籽多糖組（low-dose Perilla frutescens seeds polysaccharide group，L-PFSP 組）、中劑量紫蘇籽多糖組（middle-dose Perilla frutescens polysaccharide group，M-PFSP組）和高劑量紫蘇籽多糖組（high-dose Perilla frutescens seeds polysaccharide group，H-PFSP組）（n=30）。在 8周試驗期間，CK 組飼喂普通日糧，而其他組飼喂高脂飲食。L-PFSP組、M-PFSP組和H-PFSP組分別口服紫蘇籽多糖50、100 mg/（kg·d）和200 mg/（kg·d）。每周記錄小鼠的體質(zhì)量和采食量。

1.3.2 樣品采集

在第8周時，各組小鼠處死前12 h禁食不禁水。各組小鼠按2.0 g/kg體質(zhì)量注射氨基甲酸乙酯進行麻醉，眼眶靜脈竇取血至抗凝管中，并測定小鼠空腹血糖；抗凝管中的血液樣品（4℃，3 000 r/min，離心15 min），取血漿于-20℃保存。隨后斷頸處死小鼠，收集小鼠肝臟和腸道組織用于后續(xù)試驗。本研究中的所有實驗方案均經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院實驗動物福利倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 小鼠肝臟指數(shù)的測定

在處死小鼠之前對每只小鼠進行稱重并記錄體質(zhì)量，處死小鼠后取出肝臟進行稱重并計算肝臟指數(shù)。計算公式：肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。

1.3.3.2 血清生化指標(biāo)的測定

小鼠血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）、高密度脂蛋白 （high-density lipoprotein，HDL-C）、谷草轉(zhuǎn)氨酶 （aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （alanine aminotransferase，ALT）和血糖（blood glucose，GLU）均使用試劑盒進行測定。

1.3.3.3 肝臟中TC和TG的測定

小鼠肝臟中TC和TG的水平使用試劑盒進行檢測。取小鼠肝臟組織，按照試劑盒說明書將肝臟勻漿離心以獲得上清液（3 500 r/min，15 min，4℃），隨后按照試劑盒說明書操作步驟進行檢測。

1.3.3.4 肝臟和腸道氧化還原指標(biāo)的測定

小鼠肝臟和腸道中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化物酶（catalase，CAT）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平使用試劑盒進行測定，具體操作步驟按照相應(yīng)的說明書進行。

1.3.3.5 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR）檢測小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)基因的表達

使用RNA提取試劑盒提取肝臟中總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)計和合成目的基因上下游引物。使用試劑盒進行相對基因表達量的測定。使用2-ΔΔCt方法計算目標(biāo)基因mRNA的相對表達量。各基因引物序列如表1。

表1 引物信息Table 1 Primer Information

1.3.3.6 蛋白免疫印記（western blotting，Wb）檢測小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)蛋白的表達

將小鼠處死后立即收取肝臟組織，并切成等重的樣品，放入含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中。將肝臟組織裂解后，測定總蛋白濃度。然后，將蛋白質(zhì)樣品進行凝膠電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，將膜封閉，與一抗和二抗孵育，使用成像系統(tǒng)進行蛋白顯影。利用Quality One軟件進行蛋白灰度值測定分析，蛋白相對表達水平用“目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值”表示。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。并采用Duncan檢驗進行多重比較。使用GraphPad Prism 7.0制圖。當(dāng)P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 紫蘇籽多糖對小鼠體重和采食量的影響

試驗期間小鼠的體重的數(shù)據(jù)如圖1所示。

圖1 紫蘇籽多糖對小鼠體重和采食量的影響Fig.1 Effects of Perilla frutescens seed polysaccharides on body weight and feed intake of mice

在試驗結(jié)束時，CK組小鼠的平均體質(zhì)量為（39.32±1.62）g，而HF組小鼠平均體質(zhì)量為（49.70±1.71）g，HF組小鼠平均體質(zhì)量明顯高于CK組（P＜0.05）。L-PFSP組、M-PFSP組和H-PFSP組小鼠平均體質(zhì)量分別為（46.47±1.57）g、（43.46 ±1.52）g和（42.94±1.33）g，紫蘇籽多糖添加組小鼠平均體質(zhì)量均明顯低于HF組小鼠（P＜0.05）；并且 M-PFSP組和 H-PFSP組小鼠平均體質(zhì)量顯著低于L-PFSP組小鼠（P＜0.05）。采食量數(shù)據(jù)表明，試驗小鼠的采食量為3.3 g～6.2 g。

2.2 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟指數(shù)和血清生化指標(biāo)的影響

紫蘇籽多糖對小鼠肝臟指數(shù)和血清生化指標(biāo)的影響見表2。

表2 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟指數(shù)和血清生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of Perilla frutescens seed polysaccharides on liver index and serum biochemical indexes in mice

由表2可知，與CK組相比，飼喂高脂日糧的小鼠肝臟指數(shù)以及血清中 TC、TG、LDL-C、ALT、AST 和GLU水平顯著升高（P＜0.05），而HDL-C水平顯著降低（P＜0.05）。與HF組相比，M-PFSP組和H-PFSP組小鼠肝臟指數(shù)以及血清中 TC、TG、LDL-C、ALT、AST 和GLU水平顯著降低（P＜0.05），而HDL-C水平顯著升高（P＜0.05）。而L-PFSP組小鼠的肝臟指數(shù)以及血清生化指標(biāo)與HF組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟中TC和TG水平的影響

紫蘇籽多糖對小鼠肝臟中TC和TG水平的影響見圖2。

圖2 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟中TC和TG水平的影響Fig.2 The effect of Perilla frutescens seed polysaccharide on the levels of TC and TG in the liver of mice

由圖2可知，與CK組相比，HF組小鼠肝臟中TC和TG水平顯著升高（P＜0.05）。與HF組相比，H-PFSP組小鼠肝臟TC和TG水平顯著降低（P＜0.05）；而L-PFSP組和M-PFSP組小鼠肝臟中TC和TG水平與HF組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟和腸道抗氧化功能的影響

紫蘇籽多糖對小鼠肝臟和腸道抗氧化功能的影響見表3。

表3 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟和腸道抗氧化功能的影響Table 3 The effect of Perilla frutescens seed polysaccharide on the antioxidant function of liver and intestine in mice

由表3可知，與CK組相比，HF飲食顯著降低了小鼠肝臟和腸道中SOD、CAT和GSH-Px抗氧化酶的活性（P＜0.05），顯著提高了MDA水平（P＜0.05）。與HF組相比，日糧中PFSP的添加（M-PFSP組和H-PFSP組）顯著提高了小鼠肝臟和腸道中SOD、CAT和GSHPx的活性，顯著降低了MDA水平（P＜0.05）。此外，與HF組相比，L-PFSP組小鼠肝臟中GSH-Px活性和腸道中SOD和GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05）。

2.5 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)基因mRNA表達的影響

紫蘇籽多糖對小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)基因mRNA表達的影響見圖3。

圖3 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)基因mRNA表達的影響Fig.3 The effect of Perilla frutescens seed polysaccharide on the mRNA expression of lipid metabolism-related genes in mouse liver

由圖3可知，HF組小鼠肝臟中FAS mRNA表達水平顯著升高，CPT-1和ATGL mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。與HF組相比，紫蘇籽多糖添加組（LPFSP組、M-PFSP組和H-PFSP組）小鼠肝臟中FAS mRNA表達水平顯著降低，CPT-1和ATGL mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）。

2.6 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)蛋白表達的影響

紫蘇籽多糖對小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)蛋白表達的影響見圖4。

圖4 紫蘇籽多糖對小鼠肝臟中脂代謝相關(guān)基因蛋白表達的影響Fig.4 The effect of Perilla frutescens seed polysaccharide on the expression of lipid metabolism-related genes and proteins in the liver of mice

由圖4可知，與CK組相比，HF組小鼠肝臟中FAS蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），而CPT-1和 ATGL蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。與HF組相比，日糧中添加紫蘇籽多糖（M-PFSP組和H-PFSP組）顯著降低了小鼠肝臟中FAS蛋白表達水平（P＜0.05），顯著提高了CPT-1和ATGL蛋白表達水平（P＜0.05）。與HF組相比，L-PFSP組小鼠肝臟中 FAS、CPT-1和ATGL蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

日糧脂肪攝入已被證明是機體脂肪沉積的重要因素，但同時高脂肪日糧可增加哺乳動物的氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]。近年來，從天然產(chǎn)物中提取的生物活性化合物包括多糖、多酚、萜類化合物和生物堿已被證實可有改善高脂飲食導(dǎo)致的肥胖以及氧化應(yīng)激的發(fā)生[9-10]。在本研究中，PFSP的補充顯著改善了飼喂HF的小鼠的體重。此外，飲食中PFSP補充減少了膽固醇的合成，促進了血清中脂質(zhì)的消除，并阻止了代謝異常的發(fā)展，這對降低HF飲食引起的高脂血癥風(fēng)險具有有益作用。

先前的研究表明，長期HF飲食會導(dǎo)致體重增加以及血清生化指標(biāo)異常[11-12]，這與本研究結(jié)果一致。在本研究中，HF飼喂導(dǎo)致小鼠體重顯著增加，血清中TC、TG和LDL-C顯著升高，HDL-C顯著降低。血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C指標(biāo)常用于臨床上高脂血癥的診斷。但PFSP的補充顯著降低了小鼠的體重和血清中TC、TG和LDL-C水平，提高了HDL-C水平。這提示PFSP可改善HF飲食導(dǎo)致的小鼠高脂血癥。當(dāng)前一些其他研究也證實了植物多糖可改善高脂血癥[6，13-14]?？阻Φ萚15]研究表明，在小鼠日糧中添加黃精多糖后，高脂血癥小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平顯著降低，且隨黃精多糖含量的增加效果更好?？崭寡鞘翘悄虿z測的最常用指標(biāo)，可反應(yīng)胰島β細(xì)胞的功能和基礎(chǔ)胰島素的分泌功能。通常，機體脂代謝異常往往伴隨著糖代謝異常。在本研究中，HF飼喂小鼠空腹血糖顯著升高，這與其他研究結(jié)果一致。日糧中補充PFSP后，HF飲食小鼠血糖顯著降低，表明PFSP改善了小鼠糖代謝異常。研究表明，多糖主要從調(diào)節(jié)機體胰島素敏感性、調(diào)節(jié)糖代謝過程中關(guān)鍵酶α-葡萄糖苷酶的活性和調(diào)節(jié)腸道菌群等途徑改善肥胖導(dǎo)致的機體糖脂代謝異常[16]。此外，本研究的結(jié)果還表明PFSP的補充降低了HF飲食小鼠血清中ALT和AST水平以及肝臟中TC和TG水平。血清中ALT和AST水平的升高表明小鼠肝功能異常。而肝臟中TC和TG水平的升高表明HF飲食可能導(dǎo)致了小鼠出現(xiàn)脂肪肝。而PFSP的補充改善了因HF飲食導(dǎo)致的小鼠肝功能異常和脂肪肝的進一步發(fā)展。

已證明肥胖與體內(nèi)氧化應(yīng)激的增加密切相關(guān)，而高脂肪食物的攝入是導(dǎo)致肥胖的主要因素。據(jù)報道，體重的增加對細(xì)胞抗氧化能力具有負(fù)面作用[17]。Ojetola等[18]研究表明，高果糖高脂肪飲食顯著降低了小鼠肝臟中GSH-Px和SOD活性。Miah等[4]研究也發(fā)現(xiàn)，HF飲食喂養(yǎng)的大鼠血漿和肝臟中氧化應(yīng)激參數(shù)如MDA、NO 和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平顯著升高。ROS的升高會導(dǎo)致體內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞膜降解并產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA，干擾蛋白質(zhì)等生物分子的生物活性。此外，夏淑芳[19]研究發(fā)現(xiàn)，高脂日糧能夠顯著升高腎臟中ROS含量和肝臟中MDA含量，同時腎臟中SOD，CAT活性顯著降低。在本研究中，HF飲食導(dǎo)致小鼠肝臟和腸道中抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）活性顯著降低，MDA水平顯著升高。然而，PFSP的補充顯著降低了HF飲食小鼠肝臟和腸道中MDA水平，提高SOD、CAT和GSH-Px活性。這表明PFSP可通過提高小鼠機體的抗氧化酶活性來降低HF飲食導(dǎo)致的小鼠氧化應(yīng)激。

本研究也探究了PFSP補充對HF飲食小鼠脂肪酸合成基因（FAS）和脂肪酸分解相關(guān)基因（CPT-1和ATGL）mRNA和蛋白表達的影響。FAS在動物體脂沉積中發(fā)揮重要作用，其是機體組織脂肪酸合成過程中的主要限速酶。而ATGL和CPT-1則在體內(nèi)脂肪酸分解過程中扮演著重要角色[20]。ATGL能夠?qū)C體中的TG分解成游離脂肪酸，然后游離脂肪酸隨血液循環(huán)供給動物所需要的能量。而CPT-1酶系統(tǒng)是長鏈脂肪酸進入線粒體供能所必須的。當(dāng)動物禁食或長時間運動時，機體主要通過脂肪酸氧化供量，而長鏈脂肪酸作為一種主要的供能前體物質(zhì)，不能通過簡單擴散進入線粒體，必需要借助于CPT-1酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)[21]。在本研究中，HF飲食小鼠肝臟中FAS mRNA和蛋白表達水平顯著升高，而CPT-1和ATGL mRNA和蛋白表達水平顯著降低。這也初步從分子層面解釋了HF飲食小鼠導(dǎo)致的體內(nèi)脂代謝紊亂。然而，日糧補充PFSP后，HF飲食小鼠肝臟中FAS mRNA和蛋白表達水平顯著降低，而CPT-1和ATGL mRNA和蛋白表達水平顯著升高，小鼠體內(nèi)脂代謝紊亂得到改善。

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，HF飲食會引起小鼠脂代謝和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致小鼠高脂血癥和脂肪肝的發(fā)生。而PFSP能夠改善小鼠脂代謝相關(guān)指標(biāo)，提高肝臟中抗氧化酶的活性，并調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因的表達，改善HF飲食引起的小鼠氧化應(yīng)激和脂肪肝的發(fā)生。