盧緒英 方芳 李然 滕飛 公文 張進(jìn) 滕娜娜 辛秉昌 孫德剛

孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)作為一類與遺傳高度相關(guān)的神經(jīng)發(fā)育障礙疾病，其三大核心特征是：交互性社交互動障礙、交流障礙、重復(fù)性的活動和狹隘的興趣，最早可于2 歲出現(xiàn)癥狀[1-2]。男女比例在2∶1～4∶1，全球發(fā)病率為1%[3]。目前沒有這種復(fù)雜的精神類疾病的根治療法，對社會保障、教育、醫(yī)療系統(tǒng)構(gòu)成了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)。而診斷只能依賴專業(yè)人員的臨床觀察和家長訪談，沒有客觀的醫(yī)學(xué)診斷標(biāo)志。研究證實口腔菌群與腸道菌群在抑郁癥、多發(fā)性硬化癥、阿爾茲海默癥和自閉癥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[4-7]。ASD患者因運動協(xié)調(diào)性缺陷，難以完成自主清潔，口腔衛(wèi)生情況差[8]。在人類微生物組計劃中，近一半(45%)的受試者的口腔細(xì)菌和糞便細(xì)菌重疊[9]?？谇患?xì)菌的持續(xù)定植可使腸道微生物群失調(diào)和慢性炎癥永久化[10]?？谇痪嚎赡芡ㄟ^單獨作用或與腸道菌群交互作用等形式參與了ASD的發(fā)病機(jī)制。傳統(tǒng)的微生物鑒別方法(微生物培養(yǎng)、PCR擴(kuò)增)難以研究整個環(huán)境樣本微生物群。為獲取更真實的生物學(xué)信息，近年來環(huán)境樣本微生物的研究多采用高通量測序技術(shù)，關(guān)于口腔菌群與ASD關(guān)系的研究較少且多采用二代測序[11-12]。由于測序長度的限制，二代測序僅能選擇16S rRNA部分可變區(qū)作為擴(kuò)增片段(V1-V3/V3-V4/V5-V6/V4)，而以SMRT為代表的三代測序技術(shù)可讀取基因全長，提高物種鑒定水平的的同時，在復(fù)雜環(huán)境群類區(qū)分中具有顯著優(yōu)勢[13]。

本研究首次應(yīng)用三代測序分析ASD患者口腔菌群，探究其與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育正常者的唾液菌群差異，為將來尋找孤獨癥譜系障礙唾液標(biāo)志物提供研究資料。

1 資料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 采樣對象的選擇 篩選出30 例孤獨癥譜系障礙兒童(ASD組)，年齡均在5 歲左右(男∶女=5∶1)。孤獨癥譜系障礙均符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊(第5版)》診斷標(biāo)準(zhǔn)。篩選出30 例神經(jīng)發(fā)育正常兒童(H組)，年齡均在5 歲左右(男∶女=17∶13)。經(jīng)與班主任訪談全部為神經(jīng)精神發(fā)育正常兒童。排除標(biāo)準(zhǔn)：在過去3 個月內(nèi)使用抗生素或免疫抑制藥物；口腔軟硬組織有明顯異常；有發(fā)育畸形；全身系統(tǒng)性疾病的神經(jīng)發(fā)育正常兒童。兒童監(jiān)護(hù)人知情同意并簽署知情同意書，研究經(jīng)青島大學(xué)附屬青島市口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 樣品采集 唾液收集：采樣根據(jù)《人類微生物組計劃程序手冊》(http://hmpacc.org/resources/tools_protocols.php)和之前的研究對2 名口腔醫(yī)生進(jìn)行樣本采集培訓(xùn)。Kappa值>0.85，上午9 時收集樣本，所有受試者早晨不刷牙，采樣前2 h內(nèi)不進(jìn)食并輕漱口，用3 mL無菌EP管收集3 mL非刺激性唾液，標(biāo)記后于-4 ℃條件保存，2 h內(nèi)保存到-80 ℃冰箱。

1.2 DNA提取純化、16S rRNA基因擴(kuò)增及測序

使用MoBio Power Soil DNA Isolation Kit(QIAGEN)試劑盒純化分離唾液樣本中基因組DNA，對其16S rRNA 片段全長進(jìn)行基因擴(kuò)增，使用KAPA 2G Robust Hot Start Ready mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用PacBio測序平臺進(jìn)行SMRT測序。

1.3 生物信息學(xué)和統(tǒng)計學(xué)分析

使用USEARCH(version 10.0)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用QIIME及R語言進(jìn)行菌群統(tǒng)計分析(P<0.05即差異有統(tǒng)計學(xué)意義)。H組和C組之間多樣性及代謝差異的比較采用Studentt檢驗。通過LEfSe統(tǒng)計分析不同分組中的物種組成差異。運用ROC曲線及曲線下面積(AUC)進(jìn)行可視化分類準(zhǔn)確性分析。

2 結(jié) 果

2.1 α多樣性分析

圖1可見：多樣性指數(shù)中，ACE、Chao1和PD指數(shù)顯示H組顯著高于ASD組(P<0.05)，說明ASD患兒的唾液菌群多樣性較正常兒童下降。

圖1 受試者唾液菌群多樣性分析

2.2 β多樣性分析

圖2可見：bray-curtis算法表明，ASD組和H組之間的唾液菌群的β多樣性物種差異顯著(P<0.05)，各樣本的群落構(gòu)成存在差異，但樣本有根據(jù)病理狀態(tài)聚類的趨勢。

圖2 H組和C組唾液微生物群落結(jié)構(gòu)比較

2.3 差異性代表菌分析

在門水平，ASD患者和健康對照組的唾液菌群主要包括Firmicutes(厚壁菌門)，Proteobacteria(變形菌門)，Bacteroidetes(擬桿菌門)，Actinobacteria(放線菌門)，F(xiàn)usobacteria(梭桿菌門)，其中Firmicutes(厚壁菌門)和Proteobacteria(變形菌門)在菌群結(jié)構(gòu)比例中占大多數(shù)，分別占81.5%(ASD組)和78.5%(H組)，是絕對的優(yōu)勢菌群(圖3)。

圖3 ASD 組和H組唾液微生物群落物種構(gòu)成比較

根據(jù)LDA score>4的篩選標(biāo)準(zhǔn)(圖4)，在ASD組中：門水平差異菌為Proteobacteria(變形菌門)；屬水平差異菌為Haemophilus(嗜血桿菌屬)和Neisseria(奈瑟菌屬)；種水平差異菌為uncultured_bacterium_g_Neisseria(未命名的奈瑟菌種)。在H組中：門水平差異菌為Firmicutes(厚壁菌門)；屬水平差異菌為Streptococcus(鏈球菌屬)和Prevotella(普雷沃氏菌屬)；種水平差異菌為Streptococcus_salivarius(唾液鏈球菌種)和Streptococcus_sanguinis(血鏈球菌種)。

圖4 ASD組和H組唾液菌群差異菌

2.4 菌群功能及代謝通路分析

基于KEGG代謝通路預(yù)測唾液菌群功能特征，結(jié)果顯示兩樣品組的功能宏基因組存在顯著差異，這可能表明ASD疾病狀態(tài)下口腔微生物宏基因功能發(fā)生了巨大變化。與健康對照組相比，ASD組糖類代謝通路、翻譯、轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)(P<0.05)，而能量代謝通路、脂質(zhì)代謝通路和氨基酸代謝通路顯著上調(diào)(P<0.05)(圖5)。

圖5 ASD組和H組唾液菌群代謝差異的比較

2.5 基于唾液微生物建立ASD評估模型

首先，篩選對建模最優(yōu)的種系發(fā)育水平，發(fā)現(xiàn)利用細(xì)菌種水平圖譜可獲得性能最佳模型(AUC=80.6%，圖6)，提示唾液鏈球菌、血鏈球菌和未命名的奈瑟菌在孤獨癥譜系障礙風(fēng)險評估方面具有潛在的應(yīng)用價值。

圖6 利用唾液菌群圖譜建立孤獨癥譜系障礙分類模型

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)口腔微生態(tài)失調(diào)與阿爾茨海默病、帕金森和自閉癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)。為尋找疾病可能的早期診斷標(biāo)志，口腔微生物群落日益得到重視[14]。在本研究中，ASD兒童唾液微生物多樣性和豐富度降低，與之前研究結(jié)果部分一致[11-12,15]。這可能與地理、種族和測序技術(shù)等不同有關(guān)。

在本研究中，ASD兒童中Proteobacteria(變形菌門)增加，F(xiàn)irmicutes(厚壁菌門)降低。此外，在ASD兒童唾液中觀察到Gammaproteobacteria(丙型變形菌綱)、Pasteurellales(巴斯德氏菌目)、Betaproteobacteriales(β-變形菌綱)、Prevotellaceae(普雷沃氏菌科)、Pasteurellaceae(巴斯德氏菌科)、Neisseriaceae(奈瑟氏菌科)、Haemophilus(嗜血桿菌屬)、Neisseria(奈瑟氏菌屬)和uncultured_bacterium_g_Neisseria(未命名的奈瑟氏菌種)的豐度增加，以及Streptococcus(鏈球菌屬)、Prevotella(普雷沃氏菌屬)、Streptococcus_salivarius(唾液鏈球菌種)和Streptococcus_sanguinis(血鏈球菌種)的含量減少。這些觀察結(jié)果可能有助于確定疾病的口腔微生態(tài)失衡特征。以種水平3 種差異菌建立的評估模型準(zhǔn)確率達(dá)80.6%。Haemophilus(嗜血桿菌屬)和Streptococcus_salivarius(唾液鏈球菌種)的類似趨勢得到先前研究研究結(jié)果的支持[12,15]。Haemophilus(嗜血桿菌屬)常在免疫功能低下的的人群中檢出[16]。Streptococcus_salivarius(唾液鏈球菌種)因其能夠抑制IL-6和IL-8等炎性因子的活化，而作為安全有效的口腔益生菌得到廣泛應(yīng)用[17]。本研究中ASD兒童口腔微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝特征的改變，得到先前的ASD兒童腸道微生物改變的支持[18]。

一方面，在腸道菌群中，ASD兒童中的Firmicutes(厚壁菌門)、Prevotella(普雷沃氏菌屬)豐富明顯降低。Prevotella(普雷沃氏菌屬)在參與糖類代謝和纖維素代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，碳水化合物消化障礙是ASD患者的病理機(jī)制，同時ASD兒童普遍拒絕果蔬類而更偏愛高脂肪類食物[19]，本研究結(jié)果中的ASD兒童唾液菌群糖類代謝功能減退。因此富含纖維素的食物攝入減少及Firmicutes(厚壁菌門)和Prevotella(普雷沃氏菌屬)豐度減少，可能與ASD兒童胃腸道功能紊亂有關(guān)。ASD人群對感覺的處理主要分為3 種模式：感覺超敏、感覺低敏和感覺尋求。當(dāng)果糖不能被正常吸收時，會嚴(yán)重干擾色氨酸(TRP)的吸收，TRP作為合成神經(jīng)遞質(zhì)血清素的重要原料，參與調(diào)解情緒敏感性[20]。因此，本研究結(jié)果中的ASD兒童唾液菌群氨基酸代謝異常可能與感覺處理異常有關(guān)。脂質(zhì)在神經(jīng)元遷移、分化、形態(tài)發(fā)生、髓鞘形成和突觸可塑性等神經(jīng)發(fā)育過程中具有關(guān)鍵作用。El-Ansary等[21]發(fā)現(xiàn)二磷酸代謝、膽固醇代謝、磷脂代謝和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白在ASD病理條件下受損，與本研究ASD兒童唾液菌群脂質(zhì)代謝功能增強(qiáng)的結(jié)果相反；推測這可能是菌群對人體脂質(zhì)代謝失衡的代償反應(yīng)。另一方面，臨床研究發(fā)現(xiàn)，高脂低碳水以及適量蛋白質(zhì)的生酮飲食可以明顯減輕自閉癥典型癥狀[19]，其可能通過改善能量代謝、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和消化道微生物菌群結(jié)構(gòu)來介導(dǎo)。因此，在ASD病理狀態(tài)下，患者不僅發(fā)生營養(yǎng)物質(zhì)代謝異常、腸道菌群結(jié)構(gòu)及代謝改變，同時伴隨唾液菌群結(jié)構(gòu)及代謝改變，間接或直接影響患者神經(jīng)系統(tǒng)。

綜上所述，在孤獨癥譜系障礙兒童唾液微生物群落特征存在顯著改變，同時篩查出的種水平差異菌建立的評估模型，其辨別準(zhǔn)確率可達(dá)80.6%。利用其建立ASD風(fēng)險評估方案是否可以應(yīng)用與臨床預(yù)測高危人群，亟待進(jìn)一步研究驗證，由于本研究的樣本量、采樣位點較少，今后可加大樣本采集量、增加采樣生態(tài)位點，聯(lián)合多組學(xué)全面精確的研究孤獨癥譜系障礙患者口腔微生物信息。