王順，馮微，廖燚，夏海軍，張德華，毛峰，王健

(1.新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院骨科中心，新疆 克拉瑪依市 834000；2.新疆克拉瑪依市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，新疆 克拉瑪依市 834000；3.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院骨科，上海 200092)

骨科應(yīng)用可吸收內(nèi)植物的歷史非常悠久，最早在1 900年P(guān)ayer就將金屬鎂制作為內(nèi)固定器械應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行骨修復(fù)，到今已有100多年歷史，期間人們進(jìn)行了大量的研究[1]。2014年，鄭玉峰教授提出了可生物降解金屬植入物的概念，也就是在活體內(nèi)可以逐步降解，機(jī)體對(duì)降解產(chǎn)物反應(yīng)和諧，材料最終完全消失，局部組織損傷得到修復(fù)[2]。

2016年，美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)(American Society for Testing and Materials，ASTM)給出了ASTM-F3160標(biāo)準(zhǔn)，為可生物降解金屬植入物應(yīng)滿足植入的金屬可以直接降解，或者可以通過(guò)設(shè)定好的途徑進(jìn)行降解，最終被細(xì)胞或者組織完全代謝或者吸收。對(duì)體內(nèi)可生物降解金屬的要求是100%的可降解性及100%的生物相容性[3-4]。主要的金屬合金有三種，包括鐵合金、鎂合金及鋅合金，鐵合金降解速度過(guò)慢，鎂合金的降解速率過(guò)快，且局部易產(chǎn)生氫，因此人們逐步將研究工作轉(zhuǎn)向鋅合金[5-6]。

骨組織缺損是指因創(chuàng)傷、炎癥、骨病所致的骨質(zhì)短缺，超過(guò)臨界尺寸(>骨直徑1.5倍)的骨組織缺失稱為骨缺損，這種骨缺損超過(guò)自體修復(fù)的臨界狀態(tài)，常造成骨吸收、骨不連、延遲愈合或不愈合，最終導(dǎo)致局部功能障礙，給患者帶來(lái)巨大痛苦。目前，臨床治療骨缺損的金標(biāo)準(zhǔn)是自體骨移植[7-8]。骨移植在臨床應(yīng)用中受到較多限制，常見(jiàn)原因有：來(lái)源有限且獲得自體骨組織時(shí)增加了患者其他部位的創(chuàng)傷、繼發(fā)感染、慢性疼痛、骨折等；同種異體骨移植臨床應(yīng)用受限，是因?yàn)槠渚哂邪l(fā)生傳染疾病和產(chǎn)生免疫排異反應(yīng)的可能。因此，自體骨移植與同種異體骨移植的臨床應(yīng)用均受到較多限制。隨著材料和生物科學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用骨組織工程理念發(fā)展起來(lái)的生物替代品有望實(shí)現(xiàn)骨缺損重建、修復(fù)，甚至改善骨組織功能的目的[9-10]。

本文制備了一種鋅基合金，為了提高其成骨性，加入了鎂元素，為了提高其抗菌性能，加入了銀元素，通過(guò)對(duì)其體外生物相容性、抗菌性及成骨活性的檢測(cè)，為骨組織工程驗(yàn)證一種新的鋅基合金，為進(jìn)一步開(kāi)展骨組織工程支架的研究提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 本文研究所用的主要試劑包括細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(cell counting kit-8，CCK-8)(C0038，碧云天)盒，0.25% Trypsin-乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(25200-072，Gibco)，胎牛血清(FBS，10270106，Gibco)，α-MEM培養(yǎng)基(12571089，Gibco)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)(20012，吉諾生物)，鬼筆環(huán)肽(FITC Phalloidin)(40735ES75，YEASEN)，青-鏈霉素(BL505A，Biosharp)，多聚甲醛(80096618，國(guó)藥試劑)，TritonX-100(30188970，國(guó)藥試劑)，DAPI熒光染料(Sigma)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測(cè)試劑盒(TE0007，LEAGENE)。

研究中應(yīng)用的主要儀器包括生物安全柜(HFsafe-1200C，Heal Force)；CO2培養(yǎng)箱(HF 90，Heal Force)；冰箱(BCD-189Z，Haier)；熒光顯微鏡(BX53，Olmpus)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Multiskan GO，Thermo)，多功能酶標(biāo)儀(MULTISCAN GO，Thermo)，手持電動(dòng)勻漿器(S-18KS，萊普特)。

1.2 鋅-2銀-0.4鎂三元合金多孔支架的制備及初篩 合金原材料的準(zhǔn)備：純鋅、純鎂、純銀及合金材料由寧波博威合金材料股份有限公司制備，選擇99.99wt.%純鋅、99.99wt.%純鎂、99.99wt.%純銀作為合金材料；將純鋅、純鎂、純銀按照鋅-2銀-0.4鎂(wt.%)的比率稱重，混合后置于溫度為650℃的圓柱形石墨坩堝內(nèi)，Ar+2%六氟化硫(SF6)保護(hù)環(huán)境下高溫熔化并攪拌10 min使之充分混勻，隨后倒入預(yù)熱至100℃的低碳鋼模具內(nèi)，獲得合金鑄錠。

采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(7700 ICPMS，Agilent)測(cè)量合金中各組成的質(zhì)量百分比。篩分一定尺寸的NaCl顆粒，在一定的壓力和溫度下進(jìn)行燒結(jié)獲得NaCl預(yù)制體。將鑄錠置于NaCl預(yù)制體模具之上，加熱至430℃左右，待合金完全熔化后，通過(guò)壓力浸滲工藝獲得鋅合金與預(yù)制體的復(fù)合體，采用流水清洗，去除NaCl預(yù)制體獲得鋅合金多孔支架[6]。

1.3 細(xì)胞毒性測(cè)試 實(shí)驗(yàn)采用小鼠顱頂前成骨細(xì)胞株(MC3T3-E1)，P/S(Gibco)。采用第3-8代細(xì)胞，培養(yǎng)箱要求含有5% CO2且溫度控制在37℃。細(xì)胞培養(yǎng)基采用α-MEM(Gibco，USA)，含10%胎牛血清(FBS，Gibco)以及100 unit P/S(Gibco)。采用噻唑藍(lán)法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)測(cè)試細(xì)胞毒性。

1.4 細(xì)胞黏附 將MC3T3-E1細(xì)胞懸液濃度稀釋至1×104/mL，樣品經(jīng)過(guò)紫外消毒后分別放入24孔板中，每孔加入1 mL細(xì)胞懸液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h、1 d、3 d。細(xì)胞在材料表面黏附形貌分別采用Live/Dead染色法和掃描電鏡觀察。

1.5 細(xì)胞骨架染色 采用Alexa Fluor 488染料和DAPI染料分別用于細(xì)胞骨架染色和細(xì)胞核染色，激發(fā)波長(zhǎng)分別為488 nm和340 nm。

1.6 細(xì)胞遷移 將MC3T3-E1細(xì)胞懸液濃度稀釋至5×104/mL，以2 mL/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，用20 μL槍頭在細(xì)胞層中劃出直徑約250 μm的線。吸出培養(yǎng)基，加入浸提液2 mL。再培養(yǎng)6 h、12 h、24 h并在顯微鏡下觀察細(xì)胞在劃線處的遷移情況，使用Imaje J軟件測(cè)量的面積縮小比率。

1.7 ALP表達(dá)水平 稀釋MC3T3-E1細(xì)胞懸液濃度至5×103/mL，以2 mL/孔接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基，加誘導(dǎo)浸提液2 mL。每3天更換1次誘導(dǎo)浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)1、2、3周，吸光度值/總蛋白含量即為ALP表達(dá)水平。

1.8 礦化及Ⅰ型膠原染色 礦化采用溶度為40 mmol/L茜素紅染色，pH值用氨水調(diào)整至4.2，Ⅰ型膠原表達(dá)檢測(cè)采用溶度為0.1%的天狼星紅染色。稀釋MC3T3-E1細(xì)胞懸液濃度為5×103/mL，以2 mL/孔接種于6孔板中。培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基，加誘導(dǎo)浸提液2 mL，之后再培養(yǎng)2周。2.5%戊二醛作用30 min，PBS試劑清洗2次進(jìn)行固定。采用天狼星紅染液或者茜素紅染液染色30 min，PBS試劑清洗2次，顯微鏡下觀察。

1.9 鋅合金支架的體外抗菌性能評(píng)價(jià) 金葡菌及表葡菌購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，將金葡菌和表葡菌分別接種于胰豆酵母提取物培養(yǎng)基中與鋅-2銀-0.4鎂合金支架在生物反應(yīng)器內(nèi)共培養(yǎng)，PBS液洗脫未貼附于支架表面的細(xì)菌，將支架連同貼壁的細(xì)菌以20 kHz 超聲浴處理15 min，使貼壁的細(xì)菌與支架完全分離，并收集起來(lái)用于后續(xù)量化，以live-dead染色及細(xì)胞核計(jì)數(shù)儀測(cè)定貼附于支架表面的細(xì)菌數(shù)量及活性，并與對(duì)照組比較。

1.10 鋅合金的體外成骨誘導(dǎo)性能評(píng)估 鋅合金支架與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)，采用Western-blot和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)方法分別測(cè)定鋅合金組織工程支架對(duì)細(xì)胞骨相關(guān)基因和Osterix蛋白(OSX)、骨鈣素(osteocalcin，OC)的表達(dá)，在分子水平上研究鋅合金組織工程支架降解對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化功能的影響，探討骨響應(yīng)機(jī)理。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞毒性檢測(cè) 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果顯示鋅銀鎂合金具備較低的細(xì)胞毒性，與對(duì)照組接近(見(jiàn)圖1)，實(shí)驗(yàn)采用的1/8浸提液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，這符合目前常見(jiàn)的浸提液濃度的稀釋，也符合人體內(nèi)浸提液濃度的梯度選擇。

圖1 細(xì)胞毒性檢測(cè)

2.2 細(xì)胞骨架染色 用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色可以清晰地顯示細(xì)胞中微絲的分布，進(jìn)而表達(dá)細(xì)胞的活性(見(jiàn)圖2)，最終的細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了鋅銀鎂合金具備更低的毒性，因而具備更優(yōu)的細(xì)胞相容性(見(jiàn)圖3)。

a 對(duì)照組

圖3 細(xì)胞骨架染色結(jié)果

2.3 細(xì)胞遷移檢測(cè) 細(xì)胞遷移指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。過(guò)程中細(xì)胞不斷重復(fù)著向前方伸出突足，然后牽拉胞體的循環(huán)過(guò)程。

分組細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞鋪于6孔板中，貼壁24 h后，用20 μL槍頭在細(xì)胞層中劃出約250 μm寬的劃痕。24 h拍照記錄劃痕處的細(xì)胞遷移情況。使用Image J軟件打開(kāi)圖片后，隨機(jī)劃取6～8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。細(xì)胞劃痕24h后觀察到對(duì)照組細(xì)胞劃痕寬度恢復(fù)至35%，鋅組24%，鋅銀組27%，鋅銀鎂組33%，說(shuō)明鋅銀鎂組相對(duì)于鋅組、鋅銀組細(xì)胞能力更好，進(jìn)一步證實(shí)了鋅銀鎂合金具備更優(yōu)的細(xì)胞相容性(見(jiàn)圖4～5)。

a 對(duì)照組 b 鋅組 c 鋅銀組 d 鋅銀鎂組

圖5 劃痕試驗(yàn)面積縮小百分比 圖6 ALP表達(dá)水平比較 圖7 imaje礦化面積比率

2.4 ALP表達(dá)水平檢測(cè) 對(duì)照組、鋅組、鋅銀組、鋅銀鎂組ALP表達(dá)水平比較，結(jié)果顯示ALP表達(dá)水平與成骨性密切相關(guān)，證實(shí)鋅銀鎂合金具備更優(yōu)的成骨性(見(jiàn)圖6) 。

2.5 茜素紅染色 Imaje J軟件測(cè)量四組礦化面積比率，顯示鋅銀鎂合金組礦化面積比率更高(見(jiàn)圖7)。對(duì)照組、鋅組、鋅銀組、鋅銀鎂組茜素紅染色對(duì)比，結(jié)果顯示鋅銀鎂合金的礦化性能優(yōu)異，進(jìn)一步證實(shí)了鋅銀鎂合金具備更優(yōu)的成骨性能(見(jiàn)圖8)。

圖8 茜素紅染色結(jié)果比較(茜素紅染色，×100)

2.6 體外抗菌測(cè)試 將金黃色葡萄球菌稀釋1×105，對(duì)照組菌落總數(shù)值為1 036株，鋅組菌落總數(shù)值為8株，鋅銀組菌落總數(shù)值為14株，鋅銀鎂組菌落總數(shù)值為13株；表皮葡萄球菌稀釋1×105，對(duì)照組菌落總數(shù)值為1 010株，鋅組菌落總數(shù)值為0株，鋅銀組菌落總數(shù)值為1株，鋅銀鎂組菌落總數(shù)值為2株?？咕阅芙Y(jié)果表明三種合金具備良好的抗菌性能(見(jiàn)圖9～11)。

圖9 金葡菌及表葡菌抗菌水平比較

圖10 金葡菌抗菌水平比較 圖11 表葡菌抗菌水平比較

2.7 鋅合金的體外成骨誘導(dǎo)性能評(píng)估 成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和金屬浸提液進(jìn)行混合培養(yǎng)1～2周。OSX、OC引物在RNA水平上的表達(dá)比率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增高，顯示鎂的加入提高了材料的成骨性能，提高了純鋅的細(xì)胞相容性和成骨特性(見(jiàn)圖12)。

a OSX b OC

3 討 論

近年來(lái)，隨著新型生物醫(yī)用材料的不斷研發(fā)以及臨床需求的不斷提高，可降解金屬材料已經(jīng)成為科研工作者研究的前沿課題。鋅及其合金良好的生物相容性、易生物降解性，展現(xiàn)了作為可降解生物醫(yī)用材料的巨大優(yōu)勢(shì)和潛力。

Vojtěch等[11]首先提出了用于骨固定的鋅合金，指出鑄態(tài)鋅-3鎂合金腐蝕性能良好，但力學(xué)性能較差。針對(duì)目前鋅合金力學(xué)性能較差的問(wèn)題，本研究將銀、鎂元素添加到鋅基體中，制備鋅-2銀-0.4鎂三元合金。旨在改善鋅合金的力學(xué)性能，同時(shí)調(diào)控鋅合金的降解速率，使骨組織的生長(zhǎng)與鋅基合金的降解相一致。此外，作為醫(yī)用植入材料中添加銀后，通過(guò)銀離子的釋放，可對(duì)植入材料和周圍環(huán)境起到消炎和避免感染的作用。

鋅銀鎂合金具有更好的體外生物相容性、成骨性以及抗菌性能[12-15]，主要原因有：鎂元素是一種人體內(nèi)的必須微量元素，鎂能夠在體內(nèi)降解為鎂離子。鎂離子主要貯存于骨骼中，是多種酶的輔助因子；鎂離子還能夠刺激骨折端硬骨痂的生成、誘導(dǎo)成骨，促進(jìn)骨折愈合，并刺激軟骨生成[16-18]。在鋅鎂合金的基礎(chǔ)上加入少量銀元素，利用銀的廣譜抗菌性和不產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)[19]，開(kāi)發(fā)出具有抗菌性能的醫(yī)用鋅銀鎂合金。

綜上所述，鎂的加入提高了材料的成骨性能，銀的加入顯著提高了材料的抗菌性能，兩種元素的加入提高了純鋅的細(xì)胞相容性和成骨特性，表現(xiàn)為能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、黏附、擴(kuò)散和成骨。因此，鋅銀鎂合金有望成為骨科種植體的新選擇材料，特別是在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域。