劉依盟，鮑正好，馬 倩，李雨晴，王春婷，金銀玉，閆志鵬，賈麗娜，齊 威

（天津科技大學 生物工程學院，天津 300457）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一類能利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細菌的通稱[1]，其廣泛分布于人體、動物體、植物以及發(fā)酵食品中，部分已經(jīng)被列入可用于食品的菌種名單[2-3]。它們不僅是研究生化、遺傳、分子生物學和基因工程的理想對象，同時在工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)、食品和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān)的重要領(lǐng)域應用價值也極高[4-6]。乳酸菌在自溶過程中，會釋放胞內(nèi)蛋白酶、肽酶、酯酶等多種酶類，能夠?qū)⒌鞍?、多肽和脂肪分解成不同的風味成分或風味前體成分[7]。乳酸菌自溶物含有多種風味物質(zhì)、胞內(nèi)代謝物，可能具有潛在的營養(yǎng)、保健功能、調(diào)香調(diào)味等作用和用途。

目前，對以乳酸菌為原料，將乳酸菌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等進行降解及后加工的純天然乳酸菌抽提物的研究報道較少。因此本試驗以自溶率為評價指標，探究NaCl、溶菌酶、超聲、蛋白酶對乳酸菌自溶的影響，進一步利用Box-Behnken響應面法優(yōu)化乳酸菌抽提物制備工藝參數(shù)，并對乳酸菌抽提物的氨基酸態(tài)氮、蛋白質(zhì)、總酚、抗氧化能力、揮發(fā)性風味成分等營養(yǎng)和功能指標進行分析研究。以期明確乳酸菌抽提物含有的營養(yǎng)成分、香氣物質(zhì)和保健功能，為乳酸菌抽提物應用于食品添加劑和保健食品等領(lǐng)域提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC8198：由本實驗室保存；中性蛋白酶（50 000 U/mL）、酸性蛋白酶（100 000 U/mL）、堿性蛋白酶（300 000 U/mL）、胰蛋白酶（250 U/mg）：山東隆科特酶制劑有限公司；溶菌酶（20 000 U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B氣相色譜-5977B質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；SpectraMAX 190酶標儀：美國Molecular Devices公司；FE20 pH計：瑞士Mettler Toledo公司；Scientz-1200E超聲破碎儀：寧波新芝公司；50/30 μm二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）復合萃取頭：美國Sigma公司；HP-5極性毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌抽提物制備工藝流程及操作要點

乳酸菌培養(yǎng)→離心收集乳酸菌泥→配制乳酸菌懸液→自溶（超聲、自溶促進劑、蛋白酶等）→加熱滅酶活→離心分離→收集上清液→冷凍干燥成粉狀

乳酸菌培養(yǎng)：①活化：挑取L.plantarumCGMCC8198小菌落接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。②一級種子液：以10%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h。③二級種子液：以10%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)至對數(shù)中后期。④乳酸菌擴大培養(yǎng)：以10%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)至穩(wěn)定期。

離心收集乳酸菌泥：將乳酸菌在離心機中以4 500～5 000 r/min離心分離15～20 min。

配制乳酸菌懸液：用pH 6.8～7的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersaline，PBS）溶液重懸乳酸菌泥，懸液濃度為10%。

自溶：在適宜的溫度和pH條件下，利用超聲處理、添加一定濃度的氯化鈉、溶菌酶和蛋白酶等，使乳酸菌溶解。

加熱滅酶活：在85～95 ℃條件下保溫15 min，使溶菌酶和蛋白酶等失活。

離心分離，收集上清液：將乳酸菌在離心機中以4 500～5 000 r/min離心分離15～20 min。

冷凍干燥：上清液樣品放置冷凍干燥機物料盤內(nèi)，開機設(shè)置溫度為-40 ℃，預凍樣品4 h。凍干條件為真空度10 Pa，冷阱溫度-55 ℃。上清液通過低溫冷凍干燥制得粉狀乳酸菌抽提物。

1.3.2 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化單因素試驗

超聲功率對乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液（pH7），超聲破碎（0 ℃，工作時間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），超聲功率分別設(shè)置為90 W、190 W、285 W、380 W、475 W，測定乳酸菌自溶率。

NaCl添加量對乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液，超聲破碎（超聲功率285 W、工作時間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），分別添加2%、6%、10%、14%和18%（W/W）的NaCl，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，測定乳酸菌自溶率。

溶菌酶添加量對乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液，超聲破碎（超聲功率285 W、工作時間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），添加2%（W/W）的NaCl，分別添加1 000 U/g、3 000 U/g、5 000 U/g、7 000 U/g、9 000 U/g的溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，85～95 ℃加熱15 min滅酶，測定乳酸菌自溶率。

蛋白酶添加量對乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液，超聲破碎（超聲功率285 W、工作時間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），添加2%的NaCl，添加3 000 U/g溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h后，再分別加入5 000 U/g、7 000 U/g、9 000 U/g、11 000 U/g、13 000 U/g的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，分別在最適酶活的條件下自溶24 h，85～95 ℃加熱15 min滅酶活，測定乳酸菌自溶率。

復合蛋白酶添加量對乳酸菌自溶率的影響：配制10%乳酸菌懸浮液，超聲破碎（285 W、工作時間2 s、間隔3 s、工作次數(shù)600次），添加2%（W/W）的NaCl，添加3 000 U/g的溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h后，再分別加入2 000 U/g、6 000 U/g、10 000 U/g、14 000 U/g、18 000 U/g復合蛋白酶（胰蛋白酶∶中性蛋白酶=1∶1），45 ℃條件下自溶24 h，測定乳酸菌自溶率。

1.3.3 響應面試驗

根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計原則，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以超聲功率（X1）、溶菌酶添加量（X2）、復合蛋白酶添加量（X3）為自變量，以乳酸菌自溶率（Y）為響應值，進行3因素3水平的響應面試驗分析，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for preparation process optimization of lactic acid bacteria extract

1.3.4 測定方法

乳酸菌自溶率：紫外分光光度計（OD600nm值）檢測乳酸菌細胞密度，計算乳酸菌自溶率[8]：

式中：R為乳酸菌自溶率；a為反應前的OD600nm值；b為反應后的OD600nm值。

pH：pH計測定；還原糖測定：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[9]；總酸的測定：按照參考文獻[10]的方法；抗氧化能力測定：使用DPPH自由基清除能力試劑盒；總酚含量測定：Folin-酚比色法[11]；總黃酮含量測定：按照參考文獻[12]的方法；氨基酸態(tài)氮的測定：按照參考文獻[13]的方法。

頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜分析：乳酸菌抽提物用生理鹽水配制10%的溶液，15 mL頂空瓶裝入待測樣品5 mL，置于45 ℃恒溫水浴中平衡10 min。然后將萃取頭插入頂空瓶中，萃取頭距樣品液面距離約5 mm。萃取30 min后將萃取頭插入氣相色譜儀的進樣口，解吸3 min。色譜柱為HP-5極性毛細管柱；升溫程序：柱溫60 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；氫氣流速47.0 mL/min，分流比10∶1，氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）溫度260 ℃，進樣口溫度260 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度220 ℃，接口溫度280 ℃，溶劑延遲時間3 min，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍50～500 amu。

定性及定量方法：采用美國國家標準與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）質(zhì)譜庫檢索對比分析進行定性，采用面積歸一化法進行相對定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲功率對乳酸菌自溶的影響

超聲波是最常見的用于細胞破碎的實驗技術(shù)，不同超聲功率對乳酸菌自溶的影響如圖1所示。由圖1可知，當超聲破碎功率為285 W，乳酸菌自溶率最高，達到42.3%。隨著超聲功率的增加，乳酸菌的自溶率沒有顯著提升。因此，選擇285 W作為后續(xù)超聲破碎處理條件。

圖1 超聲功率對乳酸菌自溶的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on autolysis of lactic acid bacteria

2.1.2 NaCl添加量對乳酸菌自溶的影響

乳酸菌在285 W超聲處理后，分別添加2%、6%、10%、14%和18%（W/W）NaCl，自溶處理24 h后，不同NaCl添加量對乳酸菌自溶率的影響如圖2所示。

圖2 NaCl添加量對乳酸菌自溶的影響Fig.2 Effect of NaCl addition on autolysis of lactic acid bacteria

由圖2可知，NaCl添加量為14%時乳酸菌自溶率最高，達到了51.44%。NaCl添加量為2%時乳酸菌自溶率可以達到48.82%。說明添加NaCl可以一定程度上促進乳酸菌自溶，但是對乳酸菌自溶率的影響不顯著。在保證自溶率的同時，為了避免引入過多的鹽離子影響后續(xù)添加的酶活。因此，選擇NaCl添加量2%來促進自溶。

2.1.3 溶菌酶添加量對乳酸菌自溶的影響

乳酸菌在285 W超聲和2%的NaCl處理后，分別添加1 000 U/g、3 000 U/g、5 000 U/g、7 000 U/g、9 000 U/g的溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，不同溶菌酶添加量對乳酸菌自溶率的影響如圖3所示。由圖3可知，溶菌酶添加量為5 000 U/g時，乳酸菌自溶效率最高，可達78.18%。溶菌酶添加量＞5 000 U/g，自溶率呈現(xiàn)下降的趨勢。當溶菌酶添加量為3 000 U/g時，乳酸菌自溶率達到77.17%，與溶菌酶添加量5 000 U/g差異不大，從產(chǎn)品成本方面考量，后續(xù)試驗選擇溶菌酶添加量為3 000 U/g。

圖3 溶菌酶添加量對乳酸菌自溶的影響Fig.3 Effect of lysozyme addition on autolysis of lactic acid bacteria

2.1.4 蛋白酶添加量對乳酸菌自溶的影響

乳酸菌在285W超聲和2%的NaCl處理后，添加3000 U/g溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，再分別加入5 000 U/g、7 000 U/g、9 000 U/g、11 000 U/g、13 000 U/g的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，分別在最適酶活的條件下自溶24 h。酸性蛋白酶，堿性蛋白酶，中性蛋白酶添加量對乳酸菌自溶率的影響如表2所示。

由表2可知，中性蛋白酶促乳酸菌自溶效果優(yōu)于酸性蛋白酶和堿性蛋白酶，中性蛋白酶添加量為5 000 U/g時，乳酸菌自溶率最高，可以達到81.77%。這可能是由于乳酸菌胞內(nèi)pH環(huán)境接近中性，中性蛋白酶在此環(huán)境下酶解作用更加充分。乳酸菌的胞內(nèi)蛋白可被胰蛋白酶水解成小分子肽及游離的氨基酸，其中包括多種呈味氨基酸。呈味肽是指從食物中提取或由氨基酸合成得到的對食品風味具有一定貢獻的分子質(zhì)量低于3 000 Da的寡肽類，包括特征滋味肽和風味前體肽。呈味肽能夠賦予酶解物一定的風味。因此，為了增加乳酸菌抽提物的風味成分和提高乳酸菌自溶率，接下來進一步考察中性蛋白酶和胰蛋白酶等比例混合的復合蛋白酶對乳酸菌自溶的影響。

表2 蛋白酶添加量對乳酸菌自溶的影響Table 2 Effect of protease addition on autolysis of lactic acid bacteria

2.1.5 復合蛋白酶添加量對乳酸菌自溶的影響

乳酸菌在285W超聲和2%的NaCl處理后，添加3000 U/g溶菌酶，在37 ℃、pH7條件下自溶24 h，再分別加入2 000 U/g（胰蛋白酶∶中性蛋白酶=1∶1）、6000U/g、10000U/g、14000U/g、18 000 U/g復合蛋白酶，45℃條件下自溶24 h，復合蛋白酶添加量對乳酸菌自溶率的影響如圖4所示。由圖4可知，復合蛋白酶添加量為6 000 U/g時，乳酸菌自溶效果最高，可達83.88%。復合蛋白酶添加量為2 000～18 000 U/g時，自溶率均能達到80%以上。復合蛋白酶最適添加量為6 000 U/g。

圖4 復合蛋白酶添加量對乳酸菌自溶的影響Fig.4 Effect of compound protease addition on autolysis of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化響應面試驗結(jié)果

響應面試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，利用Design Expert軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進行多項式擬合，以超聲功率（X1）、溶菌酶添加量（X2）、復合蛋白酶添加量（X3）為自變量，以乳酸菌自溶率（Y）為因變量建立回歸方程：Y=81.30+0.850 0X1+0.861 3X2-1.06X3-0.595 0X1X2+0.510 0X1X3+1.49X2X3+2.11X12+2.67X22+3.46X32?；貧w模型方差分析見表4。

表3 乳酸菌抽提物制備工藝優(yōu)化響應面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for preparation process optimization of lactic acid bacteria extract

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

從表3及圖5可知，一次項X3，交互項X2X3，二次項X12、X22、X32對乳酸菌自溶率影響極顯著（P＜0.01）；一次項X1、X2對乳酸菌自溶率影響顯著（P＜0.05）。其中，失擬項P=0.109＞0.05，表明該方程可以預測最優(yōu)的乳酸菌自溶率。

圖5 各因素交互作用對乳酸菌自溶率影響的響應曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of interaction between each factor on autolysis of lactic acid bacteria

由響應面優(yōu)化結(jié)果可知，乳酸菌自溶的最佳理想條件為超聲功率474.997 W，溶菌酶添加量3 000.024 U/g，復合蛋白酶添加量2 000.036 U/g，在此條件下，乳酸菌自溶率的預測值為95.215%；根據(jù)實際操作的限制性，修正最佳工藝條件為超聲功率475 W，溶菌酶添加量3 000 U/g，復合蛋白酶添加量2 000 U/g，在此條件下，得到乳酸菌自溶率為94.68%，略低于預測值（95.215%），說明試驗模型合理，該結(jié)果也合理可靠。

2.3 乳酸菌抽提物主要成分分析

2.3.1 營養(yǎng)和功能指標分析

由表5可知，乳酸菌抽提物pH為6.57。乳酸菌抽提物具有多種營養(yǎng)物質(zhì)，還原糖含量為55.16 mg/g，蛋白質(zhì)含量為7 mg/g，氨基酸態(tài)氮含量達到3.85 mg/g，總酸含量為2 mg/g。乳酸菌抽提物還富含多種生物活性物質(zhì)，其中總酚含量1.40 mg/g，總黃酮含量0.15 mg/g，對DPPH自由基清除能力達到46.16%?；诖?，乳酸菌抽提物兼具潛在的營養(yǎng)性及功能性。

表5 乳酸菌抽提物營養(yǎng)和功能指標Table 5 Nutritional and functional indexes of lactic acid bacteria extract

2.3.2 揮發(fā)性成分分析

乳酸菌抽提物檢測到24種揮發(fā)性風味物質(zhì)（表6），主要包括醇類、醛類、酮類、酯類、烯烴類和芳香環(huán)類化合物。苯乙醇、反-2-壬烯-1-醇、α-松油醇、4-十二醇、苯乙醛、月桂酸、吲哚呈現(xiàn)不同種類的花香[14-16]；葉醇呈現(xiàn)青香、綠葉香[17]；苯乙醛、α-丙基苯乙醇、己酸己酯、γ-松油烯、香橙烯、肉桂酸甲酯、3-羥基己酸乙酯、壬酸具有水果甜香味[18-20]；二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪等吡嗪類物質(zhì)呈現(xiàn)烘烤香氣，是一類對食品很重要的香氣成分[21-24]。其中月桂酸（十二酸）、2,4-二甲基苯甲醛含量最高，對乳酸菌抽提物主體風味呈現(xiàn)起顯著作用，賦予乳酸菌抽提物芳香風味。

表6 乳酸菌抽提物揮發(fā)性風味物質(zhì)Table 6 Volatile flavor substances of lactic acid bacteria extract

續(xù)表

月桂酸和壬酸等中鏈脂肪酸具有抑菌和抗氧化等功能[25-27]。蒼術(shù)酮具有抑菌、保護肝臟、降血糖等作用[28]。α-松油醇具有抑菌作用。由此可見，乳酸菌抽提物具有增香調(diào)味的作用，同時兼具有保健功能[29]。

3 結(jié)論

本研究在超聲波、溶菌酶、蛋白酶單因素試驗基礎(chǔ)上，對乳酸菌抽提物制備工藝進行響應面優(yōu)化試驗，并采用多元線性回歸分析。得到乳酸菌抽提物制備最佳工藝參數(shù)：超聲功率475 W，NaCl添加量2%，溶菌酶添加量3 000 U/g，復合蛋白酶添加量2 000 U/g，在此條件下，乳酸菌的自溶率達到94.68%。乳酸菌抽提物具有多種營養(yǎng)物質(zhì)，含有3.85 mg/g氨基酸態(tài)氮，7 mg/g蛋白質(zhì)，55.16 mg/g還原糖。乳酸菌抽提物還具有生理活性物質(zhì)，含有1.40 mg/g總酚，0.15mg/g總黃酮，對DPPH自由基清除能力可以達到46.16%。

乳酸菌抽提物揮發(fā)性風味成分富含多種營養(yǎng)和功能性物質(zhì)，芳香性成分以月桂酸、2,4-二甲基苯甲醛含量最高，形成了復雜的香氣。乳酸菌抽提物兼具有營養(yǎng)、保健功能、調(diào)香等潛在用途。