吳國紅

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院<佛山市順德區(qū)龍江醫(yī)院>，廣東 佛山 528300）

子嫻前期較為普遍，該病常發(fā)生在妊娠20周內(nèi)，以高血壓、水腫、蛋白尿等為臨床常見表現(xiàn)，嚴(yán)重的患者可有心腎功能衰竭，此為導(dǎo)致孕產(chǎn)婦死亡主因之一[1]。近年來，隨著人們生活方式的改變，先兆子癇和子癇的發(fā)病率正在上升。子嫻前期在新生兒、孕產(chǎn)婦死亡率中居第二位，對孕產(chǎn)婦和兒童的安全與健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響。子嫻前期患者的臨床特征是胎盤血管床缺乏血流灌注和小動脈痙攣，這種妊娠并發(fā)癥在圍產(chǎn)期較為常見，應(yīng)及時并積極治療嚴(yán)重子癇前期患者，及早終止妊娠[2]。氧化和抗氧化的失衡在先兆子癇的病因和發(fā)病機(jī)理中非常重要。研究表明，先兆子癇患者血液中的超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低。本研究旨在探討子癇前期Nrf2和NQO1之間的關(guān)系以及NQO1對htr-8/svneo細(xì)胞侵襲性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料：本研究74例病例資料來源于醫(yī)院2018年1月至2020年1月收治的子癇前期患者，同時選取正常妊娠婦女74例，子癇前期組年齡23～36歲，平均（30.71±4.63）歲，孕周35～39周，平均（36.17±2.25）周，收縮壓143～162mmHg，平均（155.23±16.24）mmHg，舒張壓95～112mmHg，平均（103.52±8.54）mmHg，孕次1～3次，平均（2.0±0.5）次，產(chǎn)次0～1次，平均（0.6±0.1）次；對照組年齡22～37歲，平均（30.50±4.55）歲，孕周35～40周，平均（38.03±2.10）周，收縮壓110～124mmHg，平均（116.54±5.21）mmHg，舒張壓65～75mmHg，平均（68.75±3.63）mmHg，孕次1～3次，平均（2.0±0.5）次，產(chǎn)次0～1次，平均（0.6±0.1）次。

1.2 研究方法：所有研究對象均抽取空腹靜脈血，離心后取血漿，開展Nrf2和NQO1水平檢測，Nrf2水平的檢測方法為雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，血漿內(nèi)的Nrf2和酶標(biāo)本上包被的Nrf2抗體發(fā)生結(jié)合，生成結(jié)合物，其能夠和后續(xù)加入的Nrf2抗體、HRP標(biāo)記的親和素發(fā)生有效反應(yīng)，從而取得免疫復(fù)合物，在波長450nm處對OD值進(jìn)行測量，開展Nrf2濃度計算。NQO1水平測量方法同樣為雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，檢測原理與Nrf2相同。

NQO1對HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲力的檢測方法為：采用移液器對Eagle培養(yǎng)基、雙抗（1mL）以及胎牛血清（10mL）進(jìn)行吸取，將其放入到滅菌瓶內(nèi)，然后采用移液器對Eagle培養(yǎng)基吸取，吸取量為7mL，加入2mL胎牛血清和1mL二甲基亞砜，混合均勻。采用移液器對雙氧水吸取，吸取量為9.64μL，采用Eagle培養(yǎng)基加入，使其被稀釋為250μmol/L，然后以濾膜過濾。首先將細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，然后開展細(xì)胞傳代，最后開展細(xì)胞凍存。測量氧化應(yīng)激模型中ROS的方法為：將HTR-8/SVneo細(xì)胞進(jìn)行分組，對照組采用Eagle培養(yǎng)基加入，實(shí)驗(yàn)組采用雙氧水處理液加入，培養(yǎng)4h，向瓶內(nèi)加入3mL胰酶，消化后在顯微鏡下觀察，在1000r/min速度下離心5min，去除上清液，應(yīng)用PBS對細(xì)胞進(jìn)行沖洗，繼續(xù)離心5min，將上層血清去除，加入DCFH-DA溶液3mL，孵育30min，將離心管取出，繼續(xù)離心5min，將上層清液去除，應(yīng)用PBS對細(xì)胞進(jìn)行沖洗，再次離心，采用PBS對細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸，應(yīng)用流失細(xì)胞儀后實(shí)施檢測。隨后開展氧化應(yīng)激模型中細(xì)胞存活率測定，采用對數(shù)期HTR-8/SVneo細(xì)胞，移液器分組，吸取100μLPBS加入空白組每孔中，顯微鏡下棄去每孔中細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)組加雙氧水處理液，對照組加Eagle培養(yǎng)基，孵育12 h后，將雙氧水處理液去除，低速震蕩10min上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理：運(yùn)用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料（±s）采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料（n，%）采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Nrf2和NQO1表達(dá)水平比較：子癇前期患者的Nrf2和NQO1水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），子癇前期患者的Nrf2和NQO1表達(dá)水平表現(xiàn)為正相關(guān)（r=0.916，P＜0.05），詳見表1。

表1 兩組Nrf2和NQO1表達(dá)水平比較（±s）

表1 兩組Nrf2和NQO1表達(dá)水平比較（±s）

組別 n對照組 74觀察組 74 tP Nrf2（ng/mL）3.68±0.542.18±0.3919.3710.001 NQO1（ng/mL）2.61±0.411.16±0.2226.8070.001

2.2 NQO1對HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲力影響：細(xì)胞中Nrf2、NQO1蛋白以及NQO1mRNA雙氧水組和tBHQ組相較于對照組，具備更高的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ML385組與對照組的細(xì)胞中Nrf2、NQO1蛋白以及NQO1mRNA相對表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；相較于雙氧水組，雙氧水聯(lián)合ML385組的細(xì)胞中Nrf2、NQO1蛋白和NQO1mRNA相對表達(dá)水平均更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表2。

表2 NQO1對HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲力影響（±s）

表2 NQO1對HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲力影響（±s）

指標(biāo) 對照組 雙氧水組 tBHQ組 ML385組 雙氧水聯(lián)合ML385組Nrf2（ng/mL） 0.23±0.051.22±0.211.26±0.360.26±0.040.35±0.15 NQO1（ng/mL） 0.28±0.080.63±0.150.72±0.210.23±0.060.28±0.03

3 討論

重度子癇前期病因復(fù)雜，臨床上認(rèn)為與其相關(guān)的因素就有免疫調(diào)節(jié)功能異常、血管內(nèi)皮損傷、滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異常、遺傳等，但具體發(fā)病機(jī)制尚未有明確的定性。全身小動脈痙攣、內(nèi)皮功能障礙是重度子癇前期患者發(fā)病后主要病理改變[8]。該病會對胎兒發(fā)育產(chǎn)生不良影響，不利于妊娠結(jié)局，目前，對其的臨床診斷指標(biāo)有限，因此積極探索有效診斷指標(biāo)來評估重度子癇前期的程度可為該病的有效防治提供依據(jù)[9]。

Nrf2作為氧化還原轉(zhuǎn)錄因子，已在國內(nèi)外進(jìn)行了廣泛研究，它通過與抗氧化元素反應(yīng)相互作用來激活下游抗氧化酶和解毒酶基因的表達(dá)，從而保護(hù)人體免受內(nèi)源性和外源性的壓力因素的影響[11]。已知血紅素加氧酶1（HO-1）受Nrf2調(diào)節(jié)，是最重要的抗氧化劑保護(hù)蛋白，它是人體的典型保護(hù)和防御系統(tǒng)，覆蓋大腦、心臟、肝臟和其他器官。Nrf2在一般正常情況下與胞漿蛋白伴侶分子結(jié)合而處于一種抑制狀態(tài)。當(dāng)受到各種刺激時，Nrf2可與胞漿蛋白伴侶分子解離并從胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核再與ARE結(jié)合，調(diào)控下游血紅素加氧酶1、NQO l，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸半胱氨酸連接酶、細(xì)胞色素P450s和多藥耐藥蛋白等抗氧化酶的表達(dá)，從而使機(jī)體對外界刺激的抵抗力增強(qiáng)[12]。Nrf通路可產(chǎn)生抗氧化、抗炎、減輕Ca2+超載等作用。有研究顯示Nrf2基因敲除的小鼠抗氧化能力下降，哮喘炎癥加重，提示Nrf2在哮喘中具有重要的作用[13]。

有研究表明Nrf2和NQO1直接影響肝臟和胃腸道疾病的進(jìn)展[14]，但其是否參與子癇前期的病變過程暫無相關(guān)研究佐證。血漿中Nrf2、NQO1水平，子癇前期患者較正常妊娠婦女低，且兩者間呈正相關(guān)。為進(jìn)一步證明Nrf2與NQO1之間的相關(guān)性，使用了htr-8/svneo細(xì)胞，結(jié)果顯示在htr-8/svneo細(xì)胞中NQO1水平變化和Nrf2水平變化呈正相關(guān)，說明Nrf2水平下降可對Nrf2途徑的激活起抑制作用，進(jìn)而降低Nrf2途徑下游的NQO1表達(dá)。目前，先兆子癇暫無有效的治療方法及預(yù)防措施，為避免不良結(jié)局只能及時終止妊娠。PE患者胎盤的病理特征是htr-8/svneo細(xì)胞浸潤低，子宮螺旋動脈浸潤不足，導(dǎo)致血管狹窄[15]。因此，尋找增強(qiáng)htr-8/svneo細(xì)胞侵襲性的因素在子癇前期患者的治療中極為迫切及重要。氧化應(yīng)激作用下致使htr-8/svneo細(xì)胞迅速調(diào)亡大量減少，受其影響繼而細(xì)胞浸潤方向的分化發(fā)生改變，同時還影響子宮螺旋動脈的重建，致使胎盤缺氧的惡性循環(huán)加劇，進(jìn)而造成不良妊娠結(jié)局[16]。有研究稱，氧化應(yīng)激可致使先兆子癇患者h(yuǎn)tr-8/svneo細(xì)胞的侵襲性降低，但具體機(jī)制不明[17]。這些結(jié)果表明在htr-8/svneo細(xì)胞中，NQO1水平隨著Nrf2水平變化而變化，氧化應(yīng)激過程中NQO1水平的改變可增強(qiáng)（或減弱）htr-8/svneo細(xì)胞的侵襲性。

綜上所述，子癇前期患者的Nrf2、NQO1下降，其會導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力減弱，在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2可激活NQO1從而使HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)。