鄭建清 黃碧芬 肖麗華 吳 敏

1 福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院放射治療科，福建省泉州市 362000； 2 泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬人民醫(yī)院婦產(chǎn)科

宮頸癌發(fā)病率位居全球婦女惡性腫瘤第二位[1]，而我國(guó)資料顯示，宮頸癌發(fā)病率位居?jì)D科腫瘤第一位[2]。中晚期宮頸癌多以放化療為主，但仍有20%～30%患者治療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3]。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展可能是由于癌基因的激活和/或抑癌基因的失活等所致，后者導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)基因的異常表達(dá)。與腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄調(diào)控子通過(guò)多種信號(hào)通路和蛋白家屬參與癌基因的激活和/或抑癌基因的失活[4]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，BET蛋白家族是一類全新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，它們可以通過(guò)識(shí)別組蛋白上乙?；馁嚢彼釟埢⑴c之結(jié)合，從而募集轉(zhuǎn)錄激活子來(lái)實(shí)現(xiàn)染色質(zhì)的乙?；阴；娜旧|(zhì)可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。因此抑制BET蛋白家族可能抑制腫瘤進(jìn)展，成為目前治療腫瘤的潛在新藥物靶點(diǎn)[5-6]。JQ1是一種BET bromodomain抑制劑，能夠特異性地與BRD4相競(jìng)爭(zhēng)，結(jié)合到BET家族的所有溴結(jié)構(gòu)域，而不結(jié)合到BET家族以外的溴結(jié)構(gòu)域，從而將BRD4從染色質(zhì)中釋放出來(lái)，抑制BRD4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[7]。目前認(rèn)為JQ1可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其侵襲、浸潤(rùn)能力，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但具體機(jī)制不明[8]。體內(nèi)外研究表明，JQ1對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用，尤其是造血來(lái)源腫瘤細(xì)胞[9]。然而JQ1對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用尚未見系統(tǒng)報(bào)道。因此，進(jìn)一步探索JQ1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響及可能的作用機(jī)制，對(duì)設(shè)計(jì)合理的治療藥物及判斷預(yù)后具有重要意義。本文旨在探討JQl對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌HeLa細(xì)胞系，由廈門生命互聯(lián)科技有限公司提供。BRD4抑制劑JQ1購(gòu)于MCE(MedChemExpress)公司。JQ1使用前采用二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)稀釋并溶解，使JQ1儲(chǔ)存溶度調(diào)整至50mmol/L。DMEM培養(yǎng)基(High glucose with L-glutamine；with sodium pyruvate)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。胎牛血清購(gòu)自PEAK公司；0.25%胰蛋白酶(Trypsin)購(gòu)自Gibco公司；CCK-8試劑盒(cell counting kit-8)購(gòu)自Biosharp公司。磷脂結(jié)合蛋白5-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(AnnexinV-FITC/PI)凋亡試劑盒及PI周期試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒由廈門生命互聯(lián)科技有限公司提供。細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)自Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma Scientific公司。采用的試驗(yàn)儀器包括酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(酶標(biāo)分析儀，Bio-Rad公司)；Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system(美國(guó)ABI公司)；倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)等。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng):采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞，將培養(yǎng)基置于含5%濃度的CO2、37℃、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，隔天換液，每2～3d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 藥物預(yù)處理:用DMSO將BRD4抑制劑JQ1溶解為儲(chǔ)存液備用，使用時(shí)給藥組根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)需求按濃度配制稀釋制劑，對(duì)照組加入等體積的DMSO處理細(xì)胞，并作為對(duì)照。

1.2.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè):采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法檢測(cè)JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞株增殖的影響。待HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，采用0.25%的胰酶消化培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞。采用離心機(jī)對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行離心處理后重新將培養(yǎng)基加入沉渣細(xì)胞，將培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度調(diào)整至5×103個(gè)/100μl。細(xì)胞計(jì)數(shù)符合要求后，在96孔板上接種細(xì)胞，每孔接種100μl細(xì)胞懸液。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h，待細(xì)胞貼壁后，棄去殘留培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的JQ1(分別為0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L)，處理24、48、72、120h。此外，空白對(duì)照組只加JQ1和培養(yǎng)基，而對(duì)照組不加JQ1只加HeLa細(xì)胞及培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)充分時(shí)間的培養(yǎng)后，在96孔板中重新加入含100μl新培養(yǎng)基，震蕩均勻后，加入10μl CCK8試劑充分接觸。藥物與細(xì)胞充分接觸2h后，測(cè)量樣本采用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm波長(zhǎng)處的吸光度值(A值)，并通過(guò)以下公式計(jì)算不同JQ1濃度對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制率。細(xì)胞抑制率的計(jì)算公式為：抑制率(%)=[(A對(duì)照-A空白)-(A試驗(yàn)-A空白)]/(A對(duì)照-A空白)×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：根據(jù)CCK8試驗(yàn)結(jié)果，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡。本研究采用0.5μmol/L和1μmol/L的JQ1作為藥物干預(yù)措施，并設(shè)置對(duì)照組(只加入DMSO)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。將HeLa細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度調(diào)整至5×103個(gè)/100μl，隨后采用移液槍接種于6孔板上，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)70%～80%時(shí)，加入預(yù)先配置藥物，包括DMSO溶液、0.5μmol/L JQ1和1μmol/L JQ1。所有細(xì)胞混液繼續(xù)培養(yǎng)48h，隨后收集三組細(xì)胞懸液，加入預(yù)冷的磷酸鹽(PBS)緩沖液洗滌細(xì)胞懸液2遍，最后采用250μl結(jié)合液沖洗細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106個(gè)/ml。采用單道移液槍移取100μl的細(xì)胞懸液，并吹入5ml的流式管。沿流式管壁輕輕加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI溶液，輕輕搖勻細(xì)胞懸液，于室溫、避光條件下孵育15min，最后往流式管加入400μl PBS，混勻后，上流式細(xì)胞儀分析。

1.2.5 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)：采用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測(cè)JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲能力的影響。將HeLa細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%后，利用200μl移液槍頭進(jìn)行垂直劃痕。使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3次。細(xì)胞分為給藥組和對(duì)照組，給藥組JQ1的藥物濃度為1μmol/L，對(duì)照組加入同等體積的DMSO，置于孵箱中孵育，分別在0h和48h時(shí)鏡下觀察細(xì)胞的遷移情況并采集圖片。

1.2.6 不同藥物濃度JQ1處理對(duì)c-Myc及Bcl-2基因表達(dá)的影響：基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)c-Myc及Bcl-2基因表達(dá)情況。將培養(yǎng)合格的HeLa細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%，分別采用DMSO、0.5μmol/L JQ1和1μmol/L JQ1處理HeLa細(xì)胞48h。之后充分研碎細(xì)胞，加入相同體積的Trizol試劑(異硫氰酸胍)提取HeLa細(xì)胞RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行試驗(yàn)操作。將提取液中的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后根據(jù)PCR試劑盒說(shuō)明書，以c-Myc及Bcl-2特定引物，在實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀中以cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為95℃反應(yīng)2min；95℃15s，60℃40s，試驗(yàn)共完成45個(gè)循環(huán)。在60℃條件下獲取熒光信號(hào)。循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溫度從65℃升高至95℃從而獲得熔解曲線。本試驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參，并根據(jù)各組測(cè)得的循環(huán)閾值Ct計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量(mRNA相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt)。

2 結(jié)果

2.1 CCK8法檢測(cè)JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞增殖影響 JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞有顯著的增殖抑制作用，且呈劑量及時(shí)間依賴性(見表1)。在相同的作用時(shí)間下，JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制隨著濃度的增加而顯著增加(P<0.05)。在相同濃度作用下，JQ1對(duì)HeLa的生長(zhǎng)抑制作用隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(P<0.05)。在0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L三種濃度試驗(yàn)條件下，JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞24、48、72和120h的IC50分別為8.702mmol/L、11.91mmol/L、1.063mmol/L、0.134mmol/L。

表1 不同濃度、不同時(shí)間JQ1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖影響

2.2 JQl促進(jìn)HeLa細(xì)胞株凋亡分析 48h后采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡，對(duì)照組HeLa細(xì)胞凋亡率為20.38%，而0.5μmol/L JQ1組和1μmol/L JQ1組凋亡率分別為26.90%和40.33%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 JQ1抑制HeLa細(xì)胞株侵襲 本文采用劃痕試驗(yàn)驗(yàn)證JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲能力是否有影響，我們采用濃度為1.0μmol/L的JQ1處理HeLa細(xì)胞株，對(duì)照組采用DMSO處理，結(jié)果顯示JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生顯著的抑制作用，見圖1。

圖1 JQ1抑制HeLa細(xì)胞株侵襲的細(xì)胞劃痕試驗(yàn)

2.4 JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞株中c-Myc及Bcl-2 mRNA表達(dá)量的影響 在2.1 CCK8試驗(yàn)結(jié)果中，1μmol/L的JQ1處理HeLa細(xì)胞株72h可以達(dá)到50.82%的抑制，因此對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)影響較少。后續(xù)本研究采用濃度為0.5μmol/L、1μmol/L的JQl處理HeLa細(xì)胞株來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行凋亡基因的表達(dá)量檢查。藥物處理48h后提取總RNA并用qRT-PCR法檢測(cè)JQ1對(duì)c-Myc及Bcl-2表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示經(jīng)JQ1處理后的HeLa細(xì)胞c-Myc及Bcl-2表達(dá)量下降，并且隨著JQl濃度的增加mRNA表達(dá)量逐漸下降，出現(xiàn)劑量依賴性(見表2)。

表2 BRD4抑制劑JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞株中c-Myc及Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)量影響

3 討論

宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，其治療模式和療效很大程度取決于腫瘤分期和病理類型[10]。早期宮頸癌給予根治性手術(shù)往往可以獲得很好的療效[11]，但中晚期宮頸癌占新確診宮頸癌的比例則高達(dá)50%～60%，其治療模式為根治性放化療[12]。接受根治性放化療的患者，30%～35%的患者會(huì)出現(xiàn)腫瘤局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這部分患者以全身化療為主要治療手段，但療效差，5年生存率不足40%[12]。迄今為止，靶向治療和免疫治療在宮頸癌中的應(yīng)用證據(jù)極為有限[13]。晚期宮頸癌多采用化療控制，但療效極差，生存期短。因此，積極尋找針對(duì)宮頸癌的高效靶向藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

JQ1是一種BRD4小分子抑制劑，可以高度選擇性地結(jié)合到BRD4結(jié)構(gòu)域上，發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，目前JQ1在多種實(shí)體腫瘤中得到了廣泛的研究。盡管JQ1作為單一藥物應(yīng)用于某些腫瘤的治療尚處于Ⅱ期研究階段，但JQ1對(duì)多種不同遺傳背景的惡性腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用，但在JQ1抑制宮頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移方面，目前研究較少[14]，并且關(guān)于BRD4參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究也很少[15]。在口腔鱗癌Cal27系研究中發(fā)現(xiàn)，JQ1可以抑制腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移， JQ1可能是一種治療口腔鱗癌的新藥[16]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，BRD4的過(guò)度激活可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17]。在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，JQ1主要通過(guò)抑制c-Myc的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤增殖，但在侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的作用具體機(jī)制還未明確，值得深入研究[18]。

隨著研究深入，BET抑制劑發(fā)揮靶向抗腫瘤作用的機(jī)制逐漸清楚。目前認(rèn)為，BET抑制劑通過(guò)特異性地調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[18]。c-Myc和Bcl-2是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活的關(guān)鍵蛋白，其相關(guān)基因的異常改變是癌癥最重要的生物學(xué)特征[19]。在宮頸癌中的研究表明，BRD4抑制劑可以通過(guò)抑制HPV16 E6的表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療的反應(yīng)，因此有望成為宮頸癌治療的潛在新靶點(diǎn)[20]。miRNA可能是參與BRD4生物學(xué)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要分子。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中，miR-152-5p下調(diào)而BRD4上調(diào)；熒光素酶定位分析顯示，miR-152-5p可以直接與HeLa細(xì)胞和CaSki細(xì)胞中的BRD4結(jié)合[15]。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)miR-152-5p/BRD4軸，可以有效抑制 HeLa和 CaSki細(xì)胞的增殖、侵襲和EMT轉(zhuǎn)化[15]。

本研究中，筆者通過(guò)體外試驗(yàn)，初步探討了JQ1作為BET蛋白抑制劑在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的抗癌效應(yīng)。目前關(guān)于JQ1抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外研究尚未見報(bào)道。從CCK8法試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，JQ1在體外發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性，即隨著濃度的增加或時(shí)間的延長(zhǎng)，其抗腫瘤效應(yīng)明顯增強(qiáng)，可以有效抑制HeLa細(xì)胞的增殖，這與JQ1在其他實(shí)體腫瘤中的效應(yīng)是一致的[21]。流式細(xì)胞凋亡分析顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)JQ1處理的HeLa細(xì)胞株更容易發(fā)生凋亡；且其促進(jìn)凋亡的生物效應(yīng)隨JQ1濃度增加而明顯提高，說(shuō)明JQ1促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡具有濃度依賴性[22]。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)提示，JQ1可以有效抑制HeLa細(xì)胞的侵襲行為。上述基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明，JQ1可以有效抑制HeLa細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，但目前筆者尚未檢索到JQ1應(yīng)用于宮頸癌抗腫瘤治療的臨床研究，也尚不清楚JQ1抗腫瘤效應(yīng)的具體機(jī)制。在其他腫瘤中的研究表明，JQ1可能通過(guò)調(diào)節(jié)c-Myc和Bcl-2等蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[22]?？梢源_定的是，c-Myc蛋白是影響腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能最重要的生物蛋白，如細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲性等。c-Myc基因表達(dá)的下調(diào)不僅本身可以抑制癌細(xì)胞的增殖，還可以通過(guò)誘導(dǎo)抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)的降低而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。在本研究中，筆者通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，JQ1同樣通過(guò)調(diào)節(jié)c-Myc和Bcl-2等蛋白的表達(dá)發(fā)揮抑制HeLa細(xì)胞的生物學(xué)行為，這與其他腫瘤的基礎(chǔ)研究結(jié)果一致[24]。從筆者的研究結(jié)果來(lái)看，隨著JQ1濃度的增加，癌基因c-Myc和Bcl-2表達(dá)逐漸下降，進(jìn)一步證實(shí)JQ1抗腫瘤效應(yīng)具有濃度依賴性，且c-Myc和Bcl-2是JQ1發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵生物分子之一[25]。本研究為本課題項(xiàng)目的初步結(jié)果，下一步，筆者將通過(guò)LncRNA和circRNA等方面深入探討JQ1對(duì)HeLa細(xì)胞的作用機(jī)制。

綜上所述，BRD4抑制劑JQ1可以有效抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖和侵襲能力，促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，其可能機(jī)制與降低癌基因c-Myc及抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。基于本研究，JQ1可能是一種對(duì)宮頸癌具有潛在抗腫瘤能力的藥物，值得在臨床上開展試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。