岑少婷，丘 娜

（1.佛山市三水區(qū)婦幼保健院，廣東 佛山 528100；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院），廣東 廣州 510095）

連翹為筆者所在單位多個治療外感發(fā)熱、咳嗽的協(xié)定方（外感發(fā)熱藥浴方、外感咳嗽藥浴方等）中的君藥或重要藥味，具有清熱解毒、消腫散結之功效，可用于治療或組方治療感冒發(fā)熱、呼吸不暢、咽喉腫痛等癥[1-3]。根據(jù)筆者對本院所用含連翹處方進行調研結果可知，含該藥味的處方主治多種疾病，涵蓋感冒發(fā)熱、炎癥腫痛、跌打損傷等，連翹的組方、用量僅憑醫(yī)師經(jīng)驗確定，缺乏科學、準確和既符合中醫(yī)經(jīng)典理論又貼近連翹中主要活性成分體內運動過程的依據(jù)，因此有必要對連翹及其主要活性成分的吸收、分布、代謝、排泄情況進行深入、全面的研究。

連翹苷為連翹指標性成分，具有較好的抗炎、解熱、解毒活性。研究表明，連翹苷A 能夠顯著降低壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（ⅠL-1β）、白介素-6（ⅠL-6）水平，實現(xiàn)抗炎、修復創(chuàng)傷等功效，并且具有較好的抑菌、抗炎活性[4-5]。因此，在多個研究中，連翹苷均作為評價連翹或含連翹的中藥組方、制劑的檢測指標之一[6-7]。然而，上述研究多集中在含量測定、成分分析、藥理作用研究等領域，對連翹苷在生物體內的運動，尤其是服用連翹水提液后該成分的體內過程仍缺乏系統(tǒng)、深入的研究報告。

1 儀器與材料

1.1 儀器 監(jiān)測連翹苷使用超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀（型號：Aquity-UPLC-X-class-Xevo-TQMS），購自美國Waters 公司，配置含四元超高壓液相色譜泵、柱溫箱和自動進樣器、電噴霧離子源（ESⅠ）。其余儀器為5804型低溫高速離心機，購自德國Eppendorf 公司；BYN-200-2 型干式氮吹儀，購自上海秉越電子儀器有限公司；電子精密分析天平，購自瑞士Mettler-Toledo公司。

1.2 材料 連翹苷對照品（批號：110821-201816），維拉帕米對照品（批號：100223-200102）均購自中國食品藥品檢定研究院；血樣前處理和UPLC-MS檢測用乙腈、甲酸等試劑為色譜純，購自德國Merck 公司；連翹飲片購自華潤三九藥業(yè)股份有限公司；實驗用去離子水為Millipor 凈水機制備，儀器購自法國Millipore 公司。實驗用SD 大鼠購自廣東省實驗動物中心（許可證號：SYXK（粵）2018-0067）。

2 方法與結果

2.1 動物實驗SD 大鼠給予連翹提取液（相當于20mg/mL 生藥量）10mL，口服灌胃給藥，服藥后分別在0、5min、10min、15min、30min、60min、1.5h、2h、3h、4h、6h、12h、24h 時通過尾緣靜脈取血，血樣離心取血漿后，保存于預先加入肝素的1.5mL 塑料離心管中，置于-20℃冰箱保存，備用。

2.2 血樣前處理方法 取“2.1”項下保存的血漿，精密吸取100μL至干凈的1.5mL塑料離心管中，再加入300μL 乙腈，13000 轉離心10min，吸取上清液300μL，轉移至另一干凈的1.5mL 塑料離心管中，氮吹揮去溶劑，再加100μL 內標溶液（濃度為100ng/mL 的維拉帕米甲醇溶液），13000 轉離心5min混合均勻，取上清液80μL，作為供試品溶液。

2.3 UPLC-MS 檢測條件 使用ESⅠ離子源，選擇反應監(jiān)測模式（MRM），離子傳輸管溫度120℃，氮氣流速50L/h，毛細管電壓設置為3kV，碰撞氣（氬氣）流速0.16mL/min，汽化流速650L/h，汽化溫度350℃，掃描使用多反應監(jiān)測模式（MRM），檢測離子對為待測物連翹苷623/163，內標維拉帕米455/165，錐孔電壓和碰撞電壓分別為30V和25V；色譜條件為，色譜柱使用Waters BEH300 C18（50×2.1mm，1.7μm），乙腈（A）-0.1%甲酸（B）為流動相，梯度洗脫程序設定為：0.0～1.0min，5%-10%A；1.0～2.5min，10%-95%A；2.5～3.0min，95%-5%A；其它參數(shù)為，流速0.3mL/min，柱溫30℃，進樣量1μL。血漿標品（即以空白血漿為溶劑的對照品溶液）和實際血樣的TⅠC圖譜見圖1。

圖1 連翹苷血漿標品（100ng/mL）和實測血樣（1h）的UPLC-MS圖譜

2.4 體內分析方法學考察

2.4.1 標準曲線的建立 取連翹苷對照品，精密稱取約5mg，置于25mL 量瓶中，加甲醇振搖溶解并加至刻度，配制成濃度為200μg/mL 的對照品溶液。吸取上述溶液適量，與空白血漿適量于1.5mL 塑料離心管中混合均勻，制成連翹苷濃度分別為2、5、10、20、50、100、200、500、1000ng/mL的血漿標品溶液。吸取該溶液，參照“2.2”所述方法制成供試品溶液，并繼續(xù)參照“2.3”所述方法測定待測成分（連翹苷和內標，下同）的峰面積。以連翹苷和內標的峰面積比為橫坐標，對應血藥濃度為縱坐標，通過線性回歸計算得方程為y=4884.7x-12.617（r2=0.9970），表明測定方法在2～1000ng/mL血藥濃度范圍內能夠準確測定樣品中的連翹苷。

2.4.2 靈敏度檢測 參考“2.4.1”項下血漿標品溶液的制備方法，平行制得6 份濃度為1ng/mL 的含藥血漿溶液。參照“2.2”所述方法制成供試品溶液，并繼續(xù)參照“2.3”所述方法測定待測成分的峰面積。計算峰面積比、連翹苷血藥濃度和回收率及回收率的RSD。 結果得平均回收率為102.23%、RSD為9.06%，表明方法靈敏度良好，能夠滿足檢測要求。

2.4.3 準確度和精密度 參考“2.4.1”項下血漿標品溶液的制備方法，各制備6 份血藥濃度分別為5、100、800ng/mL 的含藥血漿溶液，參照“2.2”所述方法制成供試品溶液，并繼續(xù)參照“2.3”所述方法測定待測成分的峰面積。計算峰面積比、連翹苷血藥濃度和回收率及回收率的RSD。結果得平均回收率為99.91%～106.89%、RSD 為6.21%～9.47%，表明方法準確度和精密度良好。

2.4.4 血樣穩(wěn)定性 按照“2.4.3”所述的濃度制備含藥血漿溶液，分別進行如下處理：（1）含藥血漿溶液在25℃室溫下放置8h 后，參照“2.2”所述方法制成供試品溶液，并繼續(xù)參照“2.3”所述方法測定待測成分的峰面積，所得結果用以考察樣品的常溫穩(wěn)定性；（2）含藥血漿溶液參照“2.2”所述方法制成供試品溶液后，放置在UPLC-MS 的自動進樣器中（溫度設定為4℃），2h 后參照“2.3”所述方法測定待測成分的峰面積，所得結果用以考察樣品的進樣穩(wěn)定性；（3）含藥血漿溶液凍存于-20℃后，取出融解，重復上述操作3 次，之后參照“2.2”所述方法制成供試品溶液，并繼續(xù)參照“2.3”所述方法測定待測成分的峰面積，所得結果用以考察樣品的凍融穩(wěn)定性；（4）含藥血漿溶液凍存于-20℃，30 天后取出融解，之后參照“2.2”所述方法制成供試品溶液，并繼續(xù)參照“2.3”所述方法測定待測成分的峰面積，所得結果用以考察樣品的長期保存穩(wěn)定性。上述各考察項均為三個濃度每個濃度平行制備6份樣品。根據(jù)測定結果計算峰面積比、連翹苷血藥濃度和回收率及回收率的RSD。結果得平均回收率為93.881%～103.91%、RSD 為4.80%～12.67%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.4.5 基質效應 分別考察血漿和溶劑的基質效應對樣品測定的影響。血漿基質效應考察的方法為：取空白血漿100μL，放置于1.5mL 塑料離心管中，參照“2.2”所述方法處理至“氮氣吹干”，加對照品溶液（甲醇配制，濃度同“2.4.3”項下的含藥血漿溶液，同時含100ng/mL 內標）100μL，每個濃度分別配制6 份，離心5min，取上清液80μL，參照“2.3”所述方法測定待測成分的峰面積；溶劑基質效應的考察方法為，取連翹苷對照品溶液，加甲醇稀釋配置成濃度為5、100、800ng/mL的溶液，參照“2.2”所述方法制成供試品溶液，并繼續(xù)參照“2.3”所述方法測定待測成分的峰面積。根據(jù)測定結果計算峰面積比、連翹苷血藥濃度和回收率及回收率的RSD。結果得平均回收率為94.29%～103.33%、RSD為6.26%～11.86%，表明樣品和溶劑基質對測定無明顯影響。

2.5 血藥濃度測定和藥動學參數(shù)計算 取“2.1”項下所得血漿樣品，參照“2.2”所述方法制成供試品溶液，并繼續(xù)參照“2.3”所述方法測定待測成分的峰面積。根據(jù)測定結果計算峰面積比、連翹苷血藥濃度。根據(jù)所得結果繪制血藥濃度-時間曲線，同時將數(shù)據(jù)導入DAS2.1 軟件計算藥動學參數(shù)。結果求得，Tmax=1.00h，Cmax=111.5519ng/mL，T1/2=1.801，MRT=2.905h，AUC0～i=256.217 ng/mL·h，AUC0～∞=291.336 ng/mL·h。上述結果表明（見圖2），大鼠口服連翹苷后，吸收速度較快，最大血藥濃度和體內駐留時間、代謝速率適中。

圖2 連翹苷血藥濃度-時間曲線（n=6）

3 討論

根據(jù)血藥濃度-時間曲線和藥代動力學參數(shù)可知，連翹苷口服吸收較好，在體內濃度適宜，能夠達到足夠發(fā)揮療效的峰濃度和蓄積量；同時，連翹苷的消除半衰期和平均駐留時間較為合適，表明該成分在口服吸收后不易被快速代謝和消除，能夠持續(xù)在體內發(fā)揮作用。同時，上述結果也表明，連翹水提液能夠較好地將連翹苷從藥材飲片中提取出來，為證明中藥湯劑的有效性及研究與連翹相關的功效物質基礎提供了科學研究和數(shù)據(jù)支撐。

連翹性涼味苦，歸心、肝、膽經(jīng)，具有“輕清宣散，偏于清透上半身之邪”的作用特點。李莉等[8]對連翹中主要活性成分進行的組織分布研究表明，連翹苷在服藥2h 后于腎臟中達到極值，且該成分主要分布于腎臟，在其他組織中分布相差不大。本文中藥動學參數(shù)顯示，連翹苷的Tmax=1.00h，T1/2=1.801，MRT=2.905h，可與前述文獻報道相對應，表明連翹提取物經(jīng)口服后，連翹苷相對快速地進入體循環(huán)中，集中于腎臟發(fā)揮治療作用并代謝。上述結果進一步印證了中醫(yī)組方和連翹應用的合理性，為更加精準地指導臨床開具處方提供了科學依據(jù)。

UPLC-MS 測定條件優(yōu)化方面，原先打算采用柱長為100mm（內徑、粒徑、填料材質等其余參數(shù)相同）的BEH 色譜柱，但在實際使用中發(fā)現(xiàn)該色譜柱中的連翹苷洗脫時間較長（約2min），拖慢了整體分析效率；如提升流速則導致柱壓過高，損壞色譜柱。因此，本實驗選擇50mm 短柱作為固定相，由于連翹苷和內標的檢測離子對不存在重疊，無需使用色譜方法將其分開，使用短柱時各目標峰的峰型和分離度均符合精準測定的要求，同時洗脫時間縮短，分離效率提高，結合文獻報道的測定方法[9]，因此決定采用短柱。