洪志評，張 蕓，李泰標(biāo)，鄭丁炤，吳心虹

（廈門市第五醫(yī)院，福建 廈門 361101）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種慢性全身性自身免疫病，主要病理變化為炎性滑膜炎。病變侵犯全身多個關(guān)節(jié)，以手、足小關(guān)節(jié)起病多見，具有多關(guān)節(jié)、對稱性、關(guān)節(jié)外病變的特點，也可侵犯其他系統(tǒng)變生他病。晚期關(guān)節(jié)可出現(xiàn)不同程度的僵硬畸形，影響人們的日常生活。RA 的病因尚未完全明確，病理機制亦尚未完全闡明，多種源自免疫系統(tǒng)和滑膜組織的細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子參與了疾病的發(fā)展。目前治療上多使用非甾體類抗炎藥（NSAIDS）、抗風(fēng)濕藥物、生物制劑等，但長期用藥易導(dǎo)致嚴(yán)重的胃腸道癥狀和肝、腎方面的損傷[1]。

小針刀近年來發(fā)展迅速，臨床實踐表明通過針刀系統(tǒng)治療可改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的癥狀，提高生活質(zhì)量[2-3]。小針刀療法在臨床中除了改善局部關(guān)節(jié)的變性組織，通過松解迷走神經(jīng)走行中周圍的粘連、攣縮、堵塞，改善局部供血，調(diào)控神經(jīng)平衡，達(dá)到治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，但缺乏有效的理論依據(jù)。本文通過觀察小針刀療法松解迷走神經(jīng)周圍組織對RA 的治療作用，進(jìn)一步研究小針刀療法治療RA的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF 級SD 大鼠共30 只（體重180～220g），雌雄各半，由廈門大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號：SYXK(閩)2013-0006）。

1.1.2 主要試劑TNF-α ELISA 試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；IL-6 ELISA 試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；RNA 提取試劑盒（Promega，型號：LS1040）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，型號：A5001）；QPCR 熒光染料（全式金，型號：AQ101-03）。

1.1.3 主要儀器SYL-2-6 恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；Stepone Plus 熒光定量PCR儀（ABI）；H2500R-2 高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；MULTI-SKAN FC 酶標(biāo)儀（賽默飛）。

1.2 研究方法

1.2.1 造模及分組SD 大鼠30 只，雌雄各半，分為三組，即正常組（C）、模型組（N）、針刀組（M），每組10 只，除對照組10 只注射0.1mL 生理鹽水外，其余各鼠用體積分?jǐn)?shù)為5%水合氯醛（按100g 體質(zhì)量注射0.8mL）腹腔麻醉后，于大鼠左后足跖底部常規(guī)皮膚消毒后，拉直大鼠左側(cè)后肢，用1mL微量注射器皮內(nèi)進(jìn)針至左后足跖，注射完全弗氏佐劑0.1mL 致炎，注射前用75%乙醇輕拭注射部位，造模7天后檢測RF 陽性，證明造模成功，隨機分為模型組、針刀組各10只。

1.2.2 干預(yù)方法 對照組、模型組不予特殊處理；針刀組：常規(guī)備皮、消毒，選用一次性針刀，規(guī)格0.4mm×40mm，進(jìn)針時刀口線與大鼠身體縱軸平行，刀體與皮膚切面垂直刺入，針刺至莖突前緣、莖突尖、頸1～頸7 后結(jié)節(jié)，當(dāng)?shù)度薪佑|骨面時，縱行剝離2次，每周2次，共4周。

1.2.3 動物處理 采用10%水合氯醛（0.3mL/kg）腹腔注射麻醉后，開腹開胸，取腎臟，處死前腹主動脈采血3mL，離心抽取血清，-20°C冰箱保存。

1.2.4 ELISA 實驗 各組TNF-α、IL-6 測定的操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行，見圖1（以檢測IL-6為例）。

圖1 ELlSA實驗步驟

1.2.5 QPCR 實驗 取滑膜組織在研缽中加液氮充分研磨，依照RNA 提取試劑盒（Promega）方法提取總RNA，依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）方法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ABI Stepone plus 儀進(jìn)行熒光擴增，GAPDH 作為內(nèi)參照反應(yīng)程序。反應(yīng)擴增條件：95℃30s、95℃5s、60℃30s、72℃1min，共45 個循環(huán)。檢測基因序列詳見表1；根據(jù)采用2-ΔΔCt公式計算目的基因的相對表達(dá)量，以正常組mRNA 的表達(dá)量作為“1”，再根據(jù)校正值計算出模型組及針刀組TNF-α、IL-6 mRNA相對含量。

表1 引物序列表

1.3 評價指標(biāo)

1.3.1 觀察項目 致炎前及干預(yù)4周后檢測大鼠左后足爪腫脹評分及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。（1）關(guān)節(jié)炎評分：無關(guān)節(jié)紅腫記0 分，趾關(guān)節(jié)紅腫記1 分，趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹記2分，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹記3分，踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹記4分；每個關(guān)節(jié)最高為4分，4個關(guān)節(jié)累計積分即為每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分。（2）足爪腫脹評分：RA 模型大鼠每只足爪包括5 只指關(guān)節(jié)或趾關(guān)節(jié)、1 只腕關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)，每個小關(guān)節(jié)出現(xiàn)結(jié)節(jié)和紅腫記為1分。

1.3.2 檢測項目ELISA 法測定血清中TNF-α、IL-6含量；熒光定量PCR實驗檢測滑膜中TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間及治療前后比較采用單因素方差分析（One‐way ANOVA），組間兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett′s T3檢驗；無序計數(shù)資料以頻數(shù)（f）、構(gòu)成比（P）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫脹及關(guān)節(jié)炎情況 與正常組比較，模型組后足爪腫脹評分及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分增加（P＜0.01），提示造模成功，見圖2；與模型組比較，針刀組左后足爪腫脹評分及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分減小（P＜0.05），詳見表2。

圖2 正常組及模型組大鼠左后足趾腫脹情況大體照片

表3 各組大鼠左后足爪腫脹評分及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較（± s，n=10）

表3 各組大鼠左后足爪腫脹評分及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分比較（± s，n=10）

注：與正常組比較，⑴P＜0.01；與治療前比較，②P＜0.05；與模型組比較，③P＜0.05

組別正常組模型組針刀組例數(shù)10 10 10時間治療前治療后治療前治療后治療前治療后足爪腫脹評分關(guān)節(jié)炎評分00 00 3.21±0.52⑴3.35±0.46⑴3.18±0.57⑴2.05±0.33⑴②③5.14±0.38⑴4.98±0.53⑴5.28±0.42⑴3.69±0.66⑴②③

2.2 血清指標(biāo) 模型組TNF-α 較正常組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），模型組IL-6 雖較正常組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可能與實驗大鼠數(shù)量較少有關(guān)；針刀組血清TNF-α、IL-6水平較模型組降低（P＜0.05），見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠血清TNF-α表達(dá)情況

圖4 各組大鼠血清lL-6表達(dá)情況

2.3 滑膜QPCR 模型組及針刀組滑膜組織TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)水平較正常組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；針刀組TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)較模型組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖5、圖6。

圖5 各組大滑膜中TNF-α mRNA表達(dá)情況

圖6 各組大滑膜中l(wèi)L-6 mRNA表達(dá)情況

3 討論

近年來，炎癥因子網(wǎng)絡(luò)持續(xù)的激活/調(diào)節(jié)異常與自身抗原刺激的免疫反應(yīng)，成為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎慢性炎癥存在的主要原因[4]。目前認(rèn)為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α,TNF-α）、IL-6、IL-17直接參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis,RA）關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)軟骨的炎癥及破壞。本實驗中，模型組左后足趾明顯紅腫，血清及滑膜中TNF-α、IL-6 均較正常組升高，說明造模成果，支持此觀點。

基于炎癥因子學(xué)說，采用抑制體內(nèi)促炎因子的多種途徑成為尋找RA 治療策略的主要方法。研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)之間具有一條通路可以拮抗炎癥反應(yīng)，即膽堿能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway），其是由迷走神經(jīng)及其遞質(zhì)乙酰膽堿和膽堿能受體所構(gòu)成[5]。當(dāng)迷走神經(jīng)受刺激時，神經(jīng)信號傳遞首先到腹部，接著通過第二條神經(jīng)進(jìn)入脾臟[6-7]，隨后釋放一種去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)[8]，這個神經(jīng)遞質(zhì)可以直接與脾臟中的免疫T 細(xì)胞“交流”，刺激免疫T細(xì)胞釋放另一種神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿與脾臟中的巨噬細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而阻止巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥蛋白。《Nature》發(fā)表的評論文章報道，通過對8 名類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者電流刺激迷走神經(jīng)每天4次，6周后發(fā)現(xiàn)其癥狀明顯改善，炎癥細(xì)胞因子（TNF-α和IL-6）顯著下降[9]。大量動物實驗結(jié)果亦表明，刺激迷走神經(jīng)和使用膽堿能激動劑在急性全身性炎癥中可抑制TNF-α、IL-1、IL-6、HMGB1 等炎癥因子的生成和釋放，抑制NF-κB 信號通路，發(fā)揮抗炎作用[5]。因此，針對迷走神經(jīng)的刺激有望成為治療自身免疫性疾病較好的方法。

小針刀療法在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎方面具有獨特療效。根據(jù)臨床報道，小針刀可以調(diào)整機體免疫功能，改善血液流變學(xué)和微循環(huán)，對粘連、瘢痕、攣縮或鈣化等變性組織有切割作用，對應(yīng)力性纖維組織和病變膨脹的滑囊，可使滑液溢出，也可起到減張作用[10]。針刀治療RA 的方法各有不同，但大部分以各大小關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)周圍軟組織為治療點[11]。本實驗通過松解大鼠莖突前緣、莖突尖、頸1～頸7 后結(jié)節(jié)，松解迷走神經(jīng)走形中的粘連、攣縮，刺激迷走神經(jīng)，結(jié)果顯示針刀組血清TNF-α、IL-6 水平較模型組降低（P＜0.05），針刀組TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)較模型組顯著降低（P＜0.01）。由此可見，小針刀刺激迷走神經(jīng)具有調(diào)控神經(jīng)平衡、抑制炎癥因子釋放的作用，從而治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。上述的《Nature》文章作者在后續(xù)報道中提及在迷走神經(jīng)刺激暫停14 天后，炎癥細(xì)胞因子又出現(xiàn)了一定程度的增加[12]，故小針刀的遠(yuǎn)期療效還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實驗通過對足爪大體情況及基因、蛋白水平檢測血清與滑膜中的典型炎癥因子，初步探討了小針刀療法治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的可能作用機制：小針刀通過刺激迷走神經(jīng)，能有效降低血清中TNF-α、IL-6水平，并下調(diào)滑膜組織中TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)，減輕滑膜炎癥反應(yīng)，故小針刀療法可能成為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎較好的方法之一。