蔡碧蓉，羅金樹(shù)

（廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東 廣州 510095）

麥柴方經(jīng)我院消化內(nèi)科醫(yī)師臨床驗(yàn)方總結(jié)、改進(jìn)而成，通常用于反流性食管炎和慢性胃炎、胃潰瘍患者的治療、輔助癥狀控制及恢復(fù)[1-2]。該方君藥為麥冬、柴胡，臣藥為法半夏、郁金，其余丹參、厚樸、蒲公英、黃芩等為佐使藥。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方療效顯著，安全性較好。由于方中藥味較多，成分復(fù)雜，有必要對(duì)其中成分進(jìn)行篩選和分析，建立多個(gè)指標(biāo)成分含量同時(shí)測(cè)定的方法，用以評(píng)價(jià)該方湯劑的質(zhì)量，更好地服務(wù)臨床實(shí)踐和患者需要。

山麥冬皂苷B 是麥冬中的主要指標(biāo)性成分，具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡的功效；同時(shí)該成分對(duì)于人胃癌細(xì)胞也具有較好的抑制作用，可以作為指標(biāo)性成分對(duì)麥柴方進(jìn)行基于功效主治的質(zhì)量評(píng)價(jià)[3-6]。柴胡中有多個(gè)皂苷類(lèi)成分，其中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D研究報(bào)道較多，且被現(xiàn)行版《中國(guó)藥典（2020 年版）》列為含量測(cè)定指標(biāo)；文獻(xiàn)報(bào)道顯示，上述成分能夠較好地對(duì)肝炎和肝癌起到抑制作用，可能是柴胡疏肝解郁、溫中行氣的物質(zhì)基礎(chǔ)[7-8]。因此，本文選擇上述兩種成分為指標(biāo)，建立含量同時(shí)測(cè)定方法，進(jìn)而評(píng)價(jià)麥柴方的質(zhì)量。

1 儀器和材料

1.1 儀器 Waters2695e 高效液相色譜儀，配備PDA 檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器，購(gòu)自美國(guó)Waters 公司；Mettler Toledo 電子精密分析天平，購(gòu)自瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 材料和試劑 柴胡皂苷A（批號(hào)：110777-201912）、柴胡皂苷D（批號(hào)：110778-201912）和山麥冬皂苷B（批號(hào)：111907-201804）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)）；色譜分析和樣品制備用乙醇、乙腈、甲酸購(gòu)自德國(guó)Merck 公司，試驗(yàn)用水為Watson 純凈水。麥柴方所用藥材購(gòu)自廣州中芝園藥業(yè)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備方法 分別取柴胡皂苷A、柴胡皂苷D 和山麥冬皂苷B 對(duì)照品，精密稱(chēng)取約5mL，置于5mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得上述成分含量均為1mg/mL 的對(duì)照品溶液。取上述溶液，精密吸取各1mL，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得三者濃度均為100μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備方法 取處方量藥材，加水適量煎煮兩次，每次60min，即得麥柴方湯劑。上述湯劑紗布濾過(guò)后，濃縮至約200mL，轉(zhuǎn)移至250mL 量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，即得麥柴方標(biāo)準(zhǔn)湯劑。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)湯劑1mL，轉(zhuǎn)移至10mL 量瓶中，加乙醇稀釋并定容至刻度。所得溶液濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 含量測(cè)定方法 吸取混合對(duì)照品和供試品溶液，所用色譜柱為Waters Xbridge C18（規(guī)格為長(zhǎng)25cm，內(nèi)徑0.46cm，填料粒徑5μm），流動(dòng)相為0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?～5min，5%-5%B；5～10min，5%-25%B；10～20min，25%-75%B；20～25min，75%-5%B；25～30min，5%-5%B，后運(yùn)行時(shí)間5min；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。記錄所得對(duì)照品和供試品色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC測(cè)定麥柴方對(duì)照品和供試品溶液圖譜

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和線(xiàn)性 取山麥冬皂苷B和柴胡皂苷A 對(duì)照品溶液，分別精密吸取適量，轉(zhuǎn)移至多個(gè)5mL 量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得上述兩種成分含量均分別為5、10、20、50、100、200μg/mL的混合對(duì)照品溶液。吸取上述溶液，注入HPLC 中，使用“2.3”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各組樣品中山麥冬皂苷B和柴胡皂苷A的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)y，對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)x，使用excel 軟件進(jìn)行線(xiàn)性回歸。計(jì)算得山麥冬皂苷B的回歸方程為y=46355x+44136（r=0.99985），柴胡皂苷A 的歸回方程為y=21197x-2979.5（r=0.99975）。上述結(jié)果表明，方法線(xiàn)性良好，能夠在5～200μg/mL 的濃度范圍內(nèi)對(duì)山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定。

2.4.2 精密度考察 吸取供試品溶液，注入HPLC中，使用“2.3”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6次，記錄各組樣品中山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A的峰面積，分別計(jì)算二者峰面積的RSD。計(jì)算得山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A 峰面積的RSD 分別為1.14%和0.86%，經(jīng)對(duì)比現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定，上述結(jié)果均符合要求，即方法的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性考察 按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，吸取上述溶液，注入HPLC 中，使用“2.3”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各組樣品中山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A 的峰面積，分別計(jì)算二者的含量和含量的RSD；計(jì)算得山麥冬皂苷B和柴胡皂苷A 含量的RSD 分別為0.65% 和0.29%，經(jīng)對(duì)比現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定，上述結(jié)果均符合要求，即方法的精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別于放置后0、2、4、6、8、12 小時(shí)注入HPLC中，使用“2.3”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各組樣品中山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A 的峰面積，分別計(jì)算二者的含量和含量的RSD；計(jì)算得山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A 含量的RSD 分別為1.59%和0.98%，經(jīng)對(duì)比現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定，上述結(jié)果均符合要求，即方法所制備樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率測(cè)定 精密吸取“2.2”項(xiàng)下所制備的麥柴方標(biāo)準(zhǔn)湯劑0.5mL，轉(zhuǎn)移至10mL 量瓶中，按表1、表2 所述最終濃度加入山麥冬皂苷B和柴胡皂苷A 對(duì)照品溶液適量，分別配制成低、中、高三個(gè)添加濃度的供試品溶液。吸取上述溶液，注入HPLC 中，使用“2.3”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各組樣品中山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A的峰面積，分別計(jì)算二者的含量、回收率和回收率的RSD。計(jì)算得山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A的平均回收率分別為100.31%和99.91%，對(duì)應(yīng)RSD 分別為2.84%和3.32%，經(jīng)對(duì)比現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定，上述結(jié)果均符合要求，即方法準(zhǔn)確度良好。

表1 山麥冬皂苷B加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=3）

表2 山麥冬皂苷B加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.5 樣品測(cè)定 取處方量藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共平行制備10 份，吸取上述溶液，注入HPLC 中，使用“2.3”項(xiàng)下所述方法分析測(cè)定，記錄各組樣品中山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A 的峰面積，分別計(jì)算二者的含量。計(jì)算得10 批供試品測(cè)定結(jié)果為，山麥冬皂苷B 含量0.6545～0.7721mg/mL，柴胡皂苷A 含量0.2095～0.3440mg/mL，見(jiàn)表3。

表3 10批樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，供試品色譜圖中并未指認(rèn)出明顯的柴胡皂苷D 色譜峰，但該成分對(duì)照品峰較為明顯，故基本排除檢測(cè)方法的問(wèn)題。經(jīng)分析和驗(yàn)證，產(chǎn)生上述結(jié)果可能是由于使用純水煎煮藥材時(shí)，無(wú)法有效提取柴胡皂苷D，即麥柴方湯劑中并不含此類(lèi)成分。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果和臨床使用情況，選擇不將柴胡皂苷D 列為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

色譜條件優(yōu)化和文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果顯示，山麥冬皂苷B 和柴胡皂苷A 出峰時(shí)間差異較大，兩峰附近無(wú)干擾峰出現(xiàn)，因此本文“2.3”項(xiàng)下色譜條件能夠成功分離二者。影響測(cè)定較為明顯的因素為供試品制備方法。預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)提取方式（直接使用乙醇溶解，乙酸乙酯提取后乙醇復(fù)溶）、溶劑用量（1:5、1:10、1:20）進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取法提取效率較低，且由于萃取操作較為繁瑣，因此重復(fù)性和準(zhǔn)確度無(wú)法保證；溶劑用量考察方面，當(dāng)溶劑和標(biāo)準(zhǔn)湯劑比例為1:5、1:10 時(shí)，前者各指標(biāo)成分含量均較后者為低（結(jié)果略），而當(dāng)比例變?yōu)?:20 時(shí)，所得結(jié)果較1:10 并無(wú)明顯變化，表明“2.2”項(xiàng)下所述方法已能夠較為充分提取。