趙嘉培，洪志評(píng)，劉 輝，張軍能，黃賽娥

（1.廈門(mén)市第五醫(yī)院，福建 廈門(mén) 361101；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350001）

認(rèn)知功能障礙是腦卒中常見(jiàn)的后遺癥，不但阻礙患者的全面康復(fù)，而且嚴(yán)重地影響其日常生活活動(dòng)、社會(huì)參與、重返職場(chǎng)等[1]。腦卒中患者的早期認(rèn)知診斷對(duì)幫助醫(yī)生識(shí)別那些存在高風(fēng)險(xiǎn)并可能繼續(xù)發(fā)展的腦卒中認(rèn)知功能障礙（poststroke cognitive impairment, PSCI）具有很重要的臨床意義的[2]。近年來(lái)，血清microRNAs（miRNAs）作為生物學(xué)標(biāo)志物在神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知疾病中的作用逐漸受到關(guān)注。在阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease,AD）的研究過(guò)程中，Nimmi 等人首次證明了miR-134 介導(dǎo)的CREB-1 和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是該病可塑性缺陷的重要分子機(jī)制，提示miR-134-5p 作為AD 患者恢復(fù)可塑性的潛在治療靶點(diǎn)作用[3]。BDNF 是與突觸可塑性和記憶形成有關(guān)的重要的可塑性相關(guān)蛋白之一，海馬突觸可塑性在很大程度上依賴于BDNF 的可用性[4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)[5]，豐富的環(huán)境可以通過(guò)激活海馬SIRT1/miR-134 通路并上調(diào)下游BDNF 的表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)認(rèn)知缺陷。因此，本研究的主要目的在于檢測(cè)miR-134及其下游靶基因BDNF 在PSCI 患者血清樣本中是否發(fā)生有意義的變化。為驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本研究招募了來(lái)自PSCI、腦卒中后認(rèn)知功能正常（post-stroke cognitive normality, PSCN）及年齡匹配對(duì)照組（agematched controls,AMC）患者的血液樣本，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）技術(shù)來(lái)檢測(cè)miR-134 的相對(duì)表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）技術(shù)來(lái)檢測(cè)BDNF 表達(dá)水平，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病例來(lái)源 本研究通過(guò)了廈門(mén)市第五醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理委員會(huì)批準(zhǔn)文號(hào)：2017-XMSDWYY-012），受試者均簽署了知情同意書(shū)。研究招募來(lái)自廈門(mén)市第五醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科的56名腦卒中患者（其中認(rèn)知功能正常組29 例，認(rèn)知障礙組27 例）以及28 名非神經(jīng)系統(tǒng)患者作為對(duì)照組被試。所有納入被試年齡為55-80 歲，且腦卒中患者和對(duì)照組被試的年齡、性別、受教育程度相匹配。

1.2 腦卒中后認(rèn)知功能障礙組（PSCI）納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①本人或法定監(jiān)護(hù)人同意并已簽署知情同意書(shū)；②首次腦卒中，符合《中國(guó)各類主要腦血管病診斷要點(diǎn)2019》[6]中“腦卒中”的診斷標(biāo)準(zhǔn)，病程≤1 年；③蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（Montreal Cognitive Assessment,MoCA）＜26 分；④病情穩(wěn)定，意識(shí)清醒，生命體征穩(wěn)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)檢查證實(shí)有腦腫瘤、腦外傷、腦寄生蟲(chóng)病等可引起認(rèn)知功能障礙的其他疾病者；②存在嚴(yán)重言語(yǔ)、視力、聽(tīng)力障礙或精神障礙等影響認(rèn)知檢查者；③經(jīng)既往病歷或臨床醫(yī)生或家屬證實(shí)其之前已經(jīng)患有認(rèn)知障礙的相關(guān)疾病或在發(fā)病前有使用針對(duì)認(rèn)知障礙的藥物；④貝克抑郁量表（Beck Depression Inventory,BDI）＞13 分；⑤有酒精、藥物濫用史；⑥合并有嚴(yán)重的心、肝、腎、內(nèi)分泌系統(tǒng)和造血系統(tǒng)等疾病者；⑦妊娠及哺乳期女性；⑧正在參加影響本研究結(jié)果評(píng)價(jià)的其它臨床試驗(yàn)者。

1.3 卒中后認(rèn)知功能正常組（PSCN）納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①為同期住院缺血性腦卒中患者；②蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（MoCA）≥26 分；③其余條目皆與卒中后認(rèn)知功能障礙組相一致。排除標(biāo)準(zhǔn)：與卒中后認(rèn)知功能障礙組一致。

1.4 對(duì)照組（AMC）納入標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①來(lái)自本院同期科室內(nèi)非神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者；②無(wú)認(rèn)知功能減退的主訴；③總體認(rèn)知功能正常，MoCA篩查評(píng)分≥26。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除癡呆、腦血管病及其他存在或可引起認(rèn)知功能障礙的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾??；②存在嚴(yán)重言語(yǔ)、視力、聽(tīng)力障礙或精神障礙等影響認(rèn)知檢查者；③其余與卒中后認(rèn)知功能障礙組后五條一致。

1.5 檢測(cè)方法 收集腦卒中患者和對(duì)照組全血，樣本為患者入院后首次采集的血液，于清晨空腹采取外周肘正中靜脈血4ml，置于無(wú)添加劑普通采血管中，3 小時(shí)內(nèi)在室溫下3000rpm 離心5min 去除血細(xì)胞并收集上層血清，然后將收集的上層血清在4°C 條件下，13000rpm 離心5inin,進(jìn)一步去除殘留的血細(xì)胞，離心后收集血清置于-80°C 冰箱保存待用。排除溶血的樣本或血清量少的等不合格樣本。

1.5.1 核酸提取與逆轉(zhuǎn)錄 采用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司miRNA 提取試劑盒（型號(hào)：CW0627）進(jìn)行miRNAs 提取，操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明說(shuō)執(zhí)行。miRNAs 濃度及純度檢測(cè)采用德國(guó)Thermo 公司NanoDrop 2000c 分光光度計(jì)。本研究miRNA 濃度范圍：50-102 ng/l；miRNA 純度范圍：A260/A280比值：1.81-2.02。逆轉(zhuǎn)錄采用南京諾唯贊生物科技有限公司的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（型號(hào)：R222-01），實(shí)驗(yàn)過(guò)程按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.5.2 RT-qPCR 實(shí)時(shí)檢測(cè)microRNAs采用南京諾唯贊生物科技有限公司的ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Low ROX Premixed）（型 號(hào)：Q431-02）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程按說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。用U6作為內(nèi)部參考，然后使用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-134的相對(duì)表達(dá)。內(nèi)參基因和目的基因引物由博創(chuàng)盛世設(shè)計(jì)，廈門(mén)鉑銳生物合成，其序列為：

1.5.3 血清BDNF 測(cè)定 采用ELISA 技術(shù)測(cè)定三組患者血清BDNF 濃度，采用北京四正柏生物科技有限公司的Human BDNF 試劑盒（型號(hào)：CHE0041），測(cè) 定 儀 為Spectramax Absorbance Reader 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，各項(xiàng)操作具體程序嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0 (IBM)分析數(shù)據(jù)。Mann-Whitney U 檢 驗(yàn) 比 較AMC 組、PSCN 組 及PSCI 組的miR-134 相對(duì)表達(dá)和BDNF 水平；ANOVA 和χ2檢驗(yàn)用于計(jì)量和計(jì)數(shù)資料中；Spearman 相關(guān)分析對(duì)miR-134 表達(dá)水平和MoCA 得分、BDNF水平進(jìn)行比較。采用ROC曲線（receiver operator characteristic curve, ROC）和曲線下面積（Area under the Curve，AUC）對(duì)miR-134 的診斷能力進(jìn)行評(píng)估。最大特異性和最大靈敏度的總和作為最佳診斷臨界點(diǎn)（cut-off point）。所有例數(shù)，包括真陽(yáng)性（true positive,TP）、真陰性（true negative,TN）、假陽(yáng)性（false positive,FP）、假陰性（false negative, FN）都是通過(guò)最佳臨界點(diǎn)計(jì)算而來(lái)。靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性的計(jì)算公式如下：靈敏度=TP/（TP+FN）=真陽(yáng)性例數(shù)/所有陽(yáng)性例數(shù)；特異性=TN/（TN+FP）=真陰性例數(shù)/所有陰性例數(shù)；準(zhǔn)確度=（TN+TP）/（TN+TP+FN+FP）=所有正確診斷例數(shù)/所有例數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 三組患者一般資料比較 人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)、生化數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。其中，在AMC 組、PSCN 組、PSCI組組間糖尿病、高血壓例數(shù)存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 三組一般資料情況

2.2 三組患者的血清miRNA 表達(dá)水平比較miRNAs 的Ct 值見(jiàn)表2，其中，在AMC 組、PSCN 組、PSCI 組組間MoCA 評(píng)分存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。U6是本研究的內(nèi)參，其Ct值在3組間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.13）。血清miR-134 的相對(duì)表達(dá)水平是通過(guò)內(nèi)參Ct 值標(biāo)準(zhǔn)化得來(lái)的（2-ΔΔCt）。miR-134 的表達(dá)水平在3 組間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Kruskal-Wallis 檢驗(yàn),P＜0.01）。PSCI 組miR-134 及BDNF 表達(dá)水平最低，PSCN 組次之，AMC組最高。miR-134 及BDNF 表達(dá)水平，在PSCI 組和PSCN 組組間兩兩比較結(jié)果為：存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Mann-Whitney 檢驗(yàn),P＜0.01）；在PSCI組和AMC 組組間兩兩比較結(jié)果為：存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Mann-Whitney 檢驗(yàn)，P＜0.01）。這些結(jié)果表明，目前所觀察到的樣本是適合于進(jìn)一步分析的。與其他兩組相比，PSCI 組患者血清miR-134的相對(duì)表達(dá)是顯著下調(diào)（P＜0.01）。

表2 三組血清miR-134及BDNF水平比較

2.3 miR-134 相對(duì)表達(dá)水平與認(rèn)知功能間相關(guān)性本研究分析了MoCA 得分與血清miR-134間的相關(guān)性。通過(guò)進(jìn)行Spearman 相關(guān)分析，結(jié)果顯示MoCA 得分與血清miR-134 相對(duì)表達(dá)間存在中度正相關(guān)（r=0.613,P＜0.01）（圖1）。

圖1 miR-134相對(duì)表達(dá)水平與認(rèn)知功能間相關(guān)性

2.4 miR-134 診斷性能用于篩查PSCI 本研究采用ROC 曲線和AUC 對(duì)miR-134 的診斷能力進(jìn)行評(píng)估，見(jiàn)圖2。采用SPSS 20.0 對(duì)miR-134 的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行ROC曲線分析，ROC曲線圖見(jiàn)圖2-6，得 到AUC（95%CI）為0.849（0.749-0.948）（P＜0.01），在0.7-0.9 范圍內(nèi)，表明miR-134 診斷腦卒中后認(rèn)知功能障礙的價(jià)值中等。Cut-off point 根據(jù)SPSS 中統(tǒng)計(jì)結(jié)果中的特異度和靈敏度的總和最大值得出，Cut-off point=0.82。根據(jù)Cut-off point 計(jì)算得出TP 為24 例、FP 為11 例、TN 為18例、FN 為3 例，并計(jì)算得出：敏感度、特異度分別為88.89%、62.07%，提示miR-134 診斷腦卒中后認(rèn)知功能障礙具有較好的靈敏度及特異度。

圖2 miR-134的ROC曲線及曲線下面積

2.5 血清miR-134 表達(dá)水平與BDNF 的相關(guān)性分析PSCI 組患者血清BDNF 的表達(dá)水平為2.068（1.932，2.204），通過(guò)進(jìn)行Spearman 相關(guān)分析，結(jié)果顯示PSCI 患者血清miR-134 相對(duì)表達(dá)量與BDNF 水平呈現(xiàn)中度正相關(guān)（r = 0.734，P＜0.01）（圖3）。

圖3 miR-134表達(dá)水平與BDNF的相關(guān)性分析

3 討論

據(jù)報(bào)告，國(guó)人PSCI 的發(fā)病率約為55.9%[7]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭與社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。卒中后認(rèn)知障礙是可以早期預(yù)防和治療的疾病，因此，及早發(fā)現(xiàn)并對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)十分重要。血液生物學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)對(duì)于疾病的早期篩查有很大的幫助，研究證實(shí)[5,8]，miRNAs 在神經(jīng)系統(tǒng)的分化與發(fā)育、突觸可塑性的形成、學(xué)習(xí)記憶能力的維持等方面發(fā)揮著重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[9]：血清miR-132 表達(dá)越高則卒中后越可能發(fā)生認(rèn)知障礙。動(dòng)物研究證明：miR-132 刺激[10]軸突生長(zhǎng)，而miR-134 抑制[11-12]軸突生長(zhǎng)。因此，探討血清miR-134 表達(dá)和腦卒中后認(rèn)知功能之間的關(guān)系有助于為卒中后認(rèn)知障礙早期診斷、早期干預(yù)，為其提供更加準(zhǔn)確的客觀依據(jù)。

本研究，3 組對(duì)象的年齡、性別、受教育程度均相匹配。本研究發(fā)現(xiàn)PSCI 組血清miR-134 表達(dá)水平及血清BDNF 水平顯著下降（P＜0.01），提示miR-134與PSCI 密切相關(guān)。miR-134是首次發(fā)現(xiàn)的樹(shù)突microRNA，富集于大鼠海馬神經(jīng)元的神經(jīng)元樹(shù)突中，負(fù)性控制樹(shù)突棘[13]的大小，miR-134 通過(guò)靶向Lim 結(jié)構(gòu)域激酶1（LimK1）調(diào)節(jié)樹(shù)突脊柱的發(fā)育，而LimK1被BDNF抑制[14]。Liu等人[15]發(fā)現(xiàn)miR -134 -5p 參與了血管性癡呆（VD）大鼠的認(rèn)知功能障礙。此外，miR-134 還參與了sirt1 介導(dǎo)的CREB 和BDNF 表達(dá)調(diào)控，大鼠腦中Sirt1 缺乏導(dǎo)致miR-134 表達(dá)上調(diào)，未抑制的miR-134直接抑制CREB mRNA的翻譯，導(dǎo)致CREB和BDNF 下調(diào)，使得突觸可塑性和記憶功能受損[16]。Liu 等人[17]研究發(fā)現(xiàn)在大腦中動(dòng)脈閉塞引起的認(rèn)知功能障礙的大鼠腦中miR134升高，電針可降低大鼠海馬區(qū)miR-134 的表達(dá)，從而負(fù)調(diào)控LimK1以增強(qiáng)突觸樹(shù)突可塑性，并認(rèn)為miR-134 介導(dǎo)的LimK1 參與了電針誘導(dǎo)的海馬突觸可塑性，可以作為缺血性腦卒中恢復(fù)期改善學(xué)習(xí)、記憶能力的一個(gè)有利因素。由此推測(cè)PSCI 患者miR-134 的上調(diào)抑制了BDNF 的表達(dá)，導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙，提示血清可能是PSCI的危險(xiǎn)標(biāo)記物。本研究也發(fā)現(xiàn)，血清miR-134 水平與MoCA 評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.01）；此外，本研究構(gòu)建了PSCI 診斷的ROC 曲線，曲線下面積為0.849（P＜0.01），顯示其具有良好的應(yīng)用價(jià)值，且敏感度、特異度分別為88.89%、62.07%，可作為PCSI 診斷的較好的血清學(xué)指標(biāo)。或許，miR-134 可以作為腦卒中患者認(rèn)知康復(fù)訓(xùn)練是否有效的血清學(xué)指標(biāo)之一。

綜上所述，通過(guò)測(cè)定PSCI 患者血清中miR-134 水平或許可以作為PSCI 患者認(rèn)知功能及其變化的判斷依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性，今后將擴(kuò)大樣本量，分析不同階段的PSCI 患者體miR-134 水平變化，或從細(xì)胞和動(dòng)物層面深入探討miR-134在神經(jīng)退行性疾病中調(diào)控作用背后的分子機(jī)制，以進(jìn)一步驗(yàn)證miR-134 作為PSCI生物學(xué)標(biāo)記物的康復(fù)價(jià)值。