王亞楠，袁莉，汪莉，徐志遠，阮華，程向東，董昌武

1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230000；2.中國科學院大學附屬腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022；3.杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院，浙江 杭州 310022

慢性胃炎（chronic gastritis，CG）是由多種因素引起的黏膜炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)以上腹部疼痛、胃脘部脹滿、反酸嘈雜為主，且易反復發(fā)作，嚴重影響患者的生活質量。CG屬中醫(yī)學“胃脘痛”“痞滿”“泛酸”等范疇。胃炎的發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程，可分為淺表性胃炎、萎縮性胃炎、腸化生和異型增生。研究表明，胃炎的發(fā)展會增加患胃癌的風險。目前，臨床主要通過胃鏡和病理組織學檢查進行胃炎診斷，中醫(yī)通過望舌可以了解機體內在氣血盛衰與陰陽虛實，《臨癥驗舌法》所謂“凡內外雜癥，無一不呈其形，著其色于舌”，故在胃炎防治中可通過觀察舌象進行疾病的監(jiān)測和控制。

舌苔微生物是口腔菌群的重要組成部分，舌苔菌群的變化可以為疾病的診斷和治療提供幫助。本研究采用橫斷面研究方法，通過中醫(yī)舌診AI開放平臺系統(tǒng)對167例CG患者的舌象進行分析，同時采用高通量測序技術對樣本中的16S rDNA基因進行測序分析，以研究舌苔微生物群。

1 資料與方法

1.1 病例來源

選取2021年1－9月杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院消化內科經電子內鏡和病理組織學檢查確診的慢性萎縮性胃炎（CAG）患者86例、慢性淺表性胃炎（CSG）患者81例，同時收集其舌象圖片、舌苔樣本及病歷資料。本研究經中國科學院大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（IRB-2019-56）。

1.2 診斷標準

參照《中國慢性胃炎共識意見（2017年，上海）》，CG的內鏡診斷系指肉眼或特殊成像方法所見的黏膜炎性變化，需與病理學檢查結果結合做出最終判斷。CSG患者內鏡結果顯示斑點和條狀紅斑，黏膜粗糙不均勻，出血點，糜爛和膽汁反流。CAG患者內鏡結果顯示胃黏膜以白色為主，褶皺變平，黏膜血管暴露，存在黏膜結節(jié)，同時，病理活檢顯示固有腺體萎縮。

1.3 納入標準

①年齡40～80歲，性別不限；②無明顯口腔疾??；③3個月內未使用過影響舌面顏色的藥物；④新診斷且未經治療；⑤有完整的舌面圖像（入組時舌象收集完成）；⑥患者均對本研究知情，并簽署知情同意書。

1.4 排除標準

①無法耐受胃鏡檢查；②合并胃癌、胃出血等腸道疾??；③合并嚴重臟器疾病及精神類疾病，語言障礙不能溝通；④哺乳期、孕期婦女；⑤不會伸舌或伸舌困難者；⑥DNA提取量不足，無法進行測序工作。

1.5 舌象采集與分析

1.5.1 采集時間與方法

于清晨患者未進食狀態(tài)下采集舌象。拍攝時囑患者放松自然地伸出舌頭，保持舌面展平、舌體放松、舌尖朝下的狀態(tài)。

1.5.2 設備和軟件

采用配備高清攝像頭的移動智能手機，支持自然光源拍攝。采用安徽中醫(yī)藥大學與合肥云診信息科技有限公司聯(lián)合研發(fā)的中醫(yī)舌診AI開放平臺系統(tǒng)，通過捕捉舌象，自動提取特征，以輔助中醫(yī)診斷。系統(tǒng)的價值取決于其校準亮度和顏色的能力，以補償來自光源和成像硬件的強度和色溫的變化。舌體區(qū)域圖像被自動分割以獲得相關的舌體特征。系統(tǒng)提取中醫(yī)舌診的主要特征，進一步生成有關長度、面積、濕度和舌部特征數(shù)量的詳細信息。結合人工判斷，形成最終分類，提取5類舌象。①舌色：淡紅舌、紅舌、絳舌；②苔色：白色、黃色；③苔的厚?。汉瘛⒈?、剝落；④苔的腐膩：腐、膩、正常；⑤舌質潤燥：即唾液面積占舌體總面積的比例（燥或潤）。

1.6 舌苔菌群分布

1.6.1 主要試劑與儀器

Pusion Hot start flex 2X Master Mix，上海儀濤生物儀器有限公司（M0536L）；DL2000 DNA Maker，Takara（3427A）；Stool DNA Kit（200），OMEGA bio-tek（D4015-02）；AMPure XT beads，Beckman（A63880）；Gene colour，北京 金博益（GBY-1）；Qubit dsDNA HS Assay Kit（500次），Invitrogen，Life technologies（Q32854）；生工50×TAE Buffer，上海 生 工（B548101-500）；Biowest Agarose G-10，BIOWEST（111860）。

常溫離心機（Eppendorf Centrifuge 5424），旋渦震蕩儀（華利達，WH-861 Vortex Shaker），三溫三控恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司，DK-8D），PCR儀（杭州朗基科學儀器有限公司，A200基因擴增儀），電泳儀（Tanon天能，EPS300），凝膠成像儀（Tanon-2500），超低溫冷凍儲存箱（中科美菱低溫科技有限責任公司，DW-HL388）。

1.6.2 樣本采集

隨機收集CAG、CSG各30例舌苔樣本，取樣前漱口，使用一次性無菌拭子刮取患者舌面3～5次，將其置于1.5 mL舌苔樣本收集小管（含保存液）中，12000 r/min離心5 min，去除上清液，置于超低溫冷凍儲存箱中備用。

1.6.3 DNA抽取與PCR擴增

對樣本舌苔進行微生物組總DNA提取，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，同時采用紫外分光光度計對DNA進行定量。利用細菌16S rDNA基因V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，引物序列：341F（5"-CCTACGGGNGGCWGCAG-3"）805R（5"-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3"），PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳確證，PCR產物由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）純化，Qubit（Invitrogen，USA）定量。擴增子池用于測序，擴增子文庫的大小和數(shù)量分別在Agilent2100生物分析儀（Agilent，美國）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美國）的文庫定量試劑盒上進行評估，樣品在Illumina NovaSeq平臺上進行測序。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 2組一般資料比較

CAG組、CSG組性別、吸煙、飲酒比較差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 CAG組和CSG組一般資料比較

2.2 2組舌象比較

舌色方面，CAG患者以紅舌為主，CSG患者以淡紅舌為主；苔色方面，CAG患者以黃苔為主，CSG患者白苔為主；苔的厚薄方面，CAG患者厚苔居多，CSG患者薄苔較多；苔的腐膩方面，CAG患者以膩苔為主，CSG患者以正常為主；舌質潤燥方面，2組均以潤為主，CAG較CSG患者燥舌增加。2組舌色、苔色、苔的厚薄及腐膩、舌質潤燥差異有統(tǒng)計學意義（＜0.01）。見表2。

表2 CAG組和CSG組舌象比較［例（%）］

2.3 2組舌苔高通量測序數(shù)據(jù)比較

對原始下機數(shù)據(jù)進行雙端拼接、質量控制、嵌合體過濾后，進行高質量數(shù)據(jù)統(tǒng)計，見表3。2組在有效片段數(shù)（=0.124）、片段長度（=0.525）、Q20%（=0.220）、Q30%（=0.160）、GC%（=0.695）等方面比較差異無統(tǒng)計學意義。

表3 舌苔高通量測序2組比較（xˉ±s，n=30）

2.4 2組舌苔菌群Alpha多樣性比較

Alpha多樣性是指一個特定環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)內的多樣性，主要反映物種豐富度和均勻度及測序深度。Alpha多 樣 性 主 要 通 過Chao1、Observed species、Goods_coverage、Shannon、Simpson等指數(shù)反映豐富度和均勻性。Chao1、Observed_species指數(shù)主要反映樣本的物種豐富度信息；Goods_coverage反映樣本的低豐度feature覆蓋情況；Simpson/Shannon主要綜合體現(xiàn)物種的豐富度（Richness）和均勻度（Eveness）。由圖1可知，CAG與CSG舌苔微生物Alpha多樣性指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），說明2組舌苔微生物群落差異顯著，CAG組的菌群多樣性明顯高于CSG組。

圖1 CAG組和CSG組舌苔菌群多樣性比較

2.5 2組舌苔菌群組成比較

Venn分析可知，2組共有菌群1213種，其中CAG組特有菌群1880種，CSG組特有菌群1264種。根據(jù)物種豐度表和物種注釋表，選取豐度最高的30個物種分類，將每個分組的相對豐度以堆疊柱狀圖形式展現(xiàn)，從而比較樣品豐度。結果顯示，在門水平，菌群分布以擬桿菌門、變形桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門為主，其中CAG組梭桿菌門的分布高于CSG組，擬桿菌門、變形桿菌門的分布低于CSG組，見圖2a；在屬水平，菌群分布以奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬_7、嗜血桿菌屬、卟啉單胞菌屬為主，其中CAG組奈瑟菌屬分布低于CSG組，卟啉單胞菌屬分布高于CSG組，見圖2b。

圖2 CAG組與CSG組舌苔菌群平均相對豐度

2.6 2組舌苔菌群顯著性差異分析

根據(jù)樣品物種豐度表，采用Mann-Whitney檢驗（適用于有生物學重復2組樣品差異比較）進行物種差異檢驗。在門水平影響分組的2種菌是梭桿菌門、Candidatus_Saccharibacteria（見圖3a），在屬水平影響分組的18種菌是鏈桿菌屬、普雷沃氏菌屬ceae_UCG-001、Ruminococcus_gnavus_group、、等（見圖3b）。

圖3 CAG組與CSG組舌苔菌群顯著性差異分析

2.7 2組舌苔菌群LEfSe差異分析

LEfSe（LDA effect size）分析主要目的是比較不同組間在豐度上有顯著差異的物種，能夠更加直觀展現(xiàn)組間所有層級的差異物種。圖4顯示，2組門水平的梭桿菌門、屬水平的有顯著差異，且在CAG組中的豐度更高。

圖4 CAG組與CSG組舌苔菌群LEfSe差異分析

2.8 舌苔菌群相關性網絡

相關性網絡圖（SparCC）是通過計算屬水平豐度top30的微生物豐度，獲得兩兩優(yōu)勢菌群間的相關性及顯著性（值），再用相關性繪制網絡圖。由圖5可見，普雷沃氏菌屬_7與普雷沃氏菌屬、韋榮氏球菌屬呈正相關，與卟啉單胞菌屬、嗜血桿菌屬呈負相關，嗜血桿菌屬與卟啉單胞菌屬、奈瑟菌屬呈正相關。與其他菌的數(shù)目關聯(lián)最多的細菌是普雷沃氏菌屬_7、嗜血桿菌屬。

圖5 CAG組與CSG組屬水平豐度top30的舌苔菌群相關性網絡

3 討論

舌象可反映機體內在氣血盛衰與陰陽虛實，近年來舌診研究在客觀化、標準化方面取得一定進步。目前大多數(shù)學者認同正常胃黏膜-CSG-CAG-癌前病變-胃癌的發(fā)展模式，認為CSG病情程度較CAG輕。中醫(yī)學認為，正常人多表現(xiàn)為淡紅舌、薄白苔，病情越發(fā)展舌象變化越明顯。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CAG患者舌象以紅舌、黃苔、厚苔、膩苔為主，CSG患者以淡紅舌、白苔、薄苔為主?！秱噼b》有“夫紅舌者，伏熱內蓄于心胃，自里而達于表也”。CAG患者舌色以紅為主，認為內有熱象。西醫(yī)學認為舌色發(fā)紅多見于感染發(fā)熱患者或慢性消耗性患者。《辨舌指南》有“黃苔主里……全舌黃苔者，臟腑俱熱”。研究發(fā)現(xiàn)，苔色受細胞生長分化和溶解退化間動態(tài)平衡影響。研究發(fā)現(xiàn)，舌苔隨細胞代謝速率改變產生敏感變化，體現(xiàn)在舌苔厚薄與細胞生長分化和溶解退化的動態(tài)改變。《溫熱經緯》有“舌苔厚而有根，濁邪瘀結”。以上均表明中醫(yī)舌診可為疾病提供潛在的篩查和早期診斷方法，欲獲得更科學的結論仍需調查更大樣本量及更精確的生物組學證據(jù)。

解剖學認為，舌與消化系統(tǒng)密切相關。脫落上皮、唾液、食物碎屑、透出的白細胞等共同組成舌苔，飲食習慣、生活方式和微生態(tài)環(huán)境等多種因素影響舌苔變化。1984年，Marshall等發(fā)現(xiàn)胃幽門螺桿菌在CG中發(fā)揮重要作用，表明細菌是導致胃炎的因素。但既往研究發(fā)現(xiàn)，約25%的CG患者沒有感染幽門螺桿菌，表明其他能夠引起炎癥的細菌參與了該過程。此后，眾多研究者證實了除幽門螺桿菌以外的細菌在胃病中的作用?，F(xiàn)代研究表明，16S rDNA基因的高通量測序在鑒定口腔微生物群中的綜合細菌方面發(fā)揮著至關重要的作用，目前已有研究者利用該技術調查了口腔細菌群落與胃炎發(fā)展的潛在關系。本研究對CAG組和CSG組舌苔微生物菌群進行檢測和分析，以探討特定圖像產生的深層原因，發(fā)現(xiàn)2組樣本中盡管存在大量相同物種，但其微生物組成、多樣性和功能存在一定差異。

本研究與既往研究結果一致，認為擬桿菌門、變形桿菌門、厚壁菌門、梭桿菌門是鑒定出的4個最具優(yōu)勢的門。在屬水平上，奈瑟菌屬、普雷沃氏菌屬_7是最豐富的屬。充分說明這些菌群在CG人群的舌苔微生物中占據(jù)重要地位，是構成口腔中舌苔微生物群落結構的最基礎成分。此外，門水平上，CAG組梭桿菌門的分布高于CSG組，梭桿菌門是口腔微生物群的常見成員。有研究發(fā)現(xiàn)梭桿菌屬m能夠引起炎癥，更有學者發(fā)現(xiàn)梭桿菌屬m可能與結直腸癌有關。擬桿菌門屬于口腔正常菌群，而擬桿菌門在CAG組的分布低于CSG組，證明梭桿菌屬m、擬桿菌門可能與胃炎的病變程度有關。屬水平上，CAG組卟啉單胞菌屬分布高于CSG組。卟啉單胞菌屬已被證明具有致癌潛力，可抑制細胞凋亡，激活細胞增殖，促進細胞入侵，誘導慢性炎癥，并直接產生致癌物。奈瑟菌屬分布低于CSG組，本結果與既往研究不一致，考慮舌苔菌群的組成和與疾病癥狀有關，如CAG患者癥狀表現(xiàn)以吐酸、噯氣為主，而CSG患者癥狀不明顯，這些癥狀表現(xiàn)都會影響舌苔菌群變化。LEfSe差異分析發(fā)現(xiàn)，梭桿菌門在2組差異有統(tǒng)計學意義，且在CAG組的豐度更高，表明CAG患者舌苔菌群結構更加豐富且存在較多優(yōu)勢菌群，口腔菌群失調程度加重。這些菌屬的改變提示CG的發(fā)展可能與炎性因子有關，由于菌群改變，導致代謝物甚至一系列全身系統(tǒng)變化。雖然目前研究缺乏關于特定細菌種類在CG發(fā)生發(fā)展過程中的確切致炎機制，但在CG患者中觀察到的微生物區(qū)系變化豐富了對口腔細菌與CG相關性的認識。

門、屬水平的特定微生物可能為舌診研究指明方向，但仍需更多研究確認特定微生物與舌質和舌苔圖像特征間的關系?；蚩赏ㄟ^觀察舌象、調整舌苔菌群的方式對胃腸道進行干預和調控，從而干預CG疾病的發(fā)展進程。此外，如何將中醫(yī)舌診與開發(fā)新的生物標志物相結合，用以預測疾病的轉歸、進行辨證論治也是需要關注的問題。