白菊萍,張菊梅

（張掖市第二人民醫(yī)院，甘肅 張掖 734000）

宮頸癌是目前唯一病因明確的婦科惡性腫瘤，與高危型人乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染密切相關(guān)。目前已經(jīng)鑒定的HPV病毒超過(guò)200種，至少40種與生殖道黏膜感染相關(guān)。根據(jù)其與宮頸癌及其癌前病變的相關(guān)性，分為高危型和低危型，高危型HPV就是能夠?qū)е聦m頸癌的一組HPV亞型，包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、等，主要存在于宮頸癌及其他的肛門(mén)生殖器癌，低危型HPV亞型包括6、11、42、43和44，主要見(jiàn)于生殖器疣等良性增生性病變[1]。低危型HPV6和HPV11與生殖器尖銳濕疣有關(guān)，而70%以上的宮頸癌與高危型HPV16和HPV18有關(guān)，是最直接致癌的HPV高危亞型[2]。宮頸癌前病變是指具癌變傾向，但目前又不能診斷為原位癌的宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)病變，具有發(fā)展成為惡性腫瘤的潛能，長(zhǎng)期存在即有可能轉(zhuǎn)變?yōu)閷m頸癌。宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)漸進(jìn)的演變過(guò)程，聯(lián)合檢測(cè)的目的就是早期發(fā)現(xiàn)，正確干預(yù)，阻止或延緩其病變發(fā)展為宮頸癌的進(jìn)程。目前常用的宮頸癌前病變篩檢方法有TCT細(xì)胞學(xué)檢查、HPV檢測(cè)、DNA定量細(xì)胞學(xué)檢測(cè)、E6/E7mRNA檢測(cè)、陰道鏡下取宮頸組織活檢等[3]。本研究分析了HPV分型檢測(cè)、TCT細(xì)胞學(xué)檢查以及兩種方法聯(lián)合檢查在宮頸癌前病變篩查中的應(yīng)用策略，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 研究對(duì)象

選取2019年7月—2020年6月在行健康體檢及宮頸癌前病變篩查的病例1 247例，年齡24～69歲，所有檢查者均有不同程度宮頸糜爛。

2 研究材料與方法

2.1 達(dá)誠(chéng)液基制片（TCT）

2.1.1 TCT制片技術(shù)

由有一定臨床經(jīng)驗(yàn)的婦產(chǎn)科醫(yī)師，刷取宮頸鱗柱交界處的上皮細(xì)胞，取材后刷頭直接放入由廣州市達(dá)誠(chéng)醫(yī)療技術(shù)有限公司提供的配套液基細(xì)胞保存瓶及保存液中送檢。TCT制片技術(shù)由廣州市達(dá)誠(chéng)醫(yī)療技術(shù)有限公司提供的沉降式全自動(dòng)液基細(xì)胞學(xué)制片染色系統(tǒng)，全自動(dòng)批量制片染色，單片獨(dú)立滴染制作，制片完成后由細(xì)胞學(xué)篩查醫(yī)師和（或）細(xì)胞學(xué)診斷醫(yī)師在顯微鏡下閱片進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷。

2.1.2 達(dá)誠(chéng)液基制片（TCT）操作方法和步驟

（1）樣本的前期處理。①標(biāo)本瓶用旋渦混合器充分振蕩30 s以上，目的是將細(xì)胞刷上的細(xì)胞震落到保存液中，并且將標(biāo)本中混有的黏液及血液震散。②標(biāo)本編號(hào)：準(zhǔn)確把離心管、申請(qǐng)單用條碼標(biāo)簽對(duì)應(yīng)貼好（或用記號(hào)筆標(biāo)注上相應(yīng)編號(hào)）。③將過(guò)濾器套在12 mL離心管內(nèi)，用3 mL軟吸管轉(zhuǎn)移樣本至離心管中，樣本轉(zhuǎn)移量約為8 mL（如樣本中的黏液較多，堵塞濾網(wǎng)，可用軟吸管輕輕攪動(dòng)幫助過(guò)濾）。④樣本轉(zhuǎn)移完畢后取出過(guò)濾器，將過(guò)濾后的標(biāo)本離心：轉(zhuǎn)速為1 650 轉(zhuǎn)/min，離心時(shí)間約5～8 min（離心注意配置平衡）。⑤標(biāo)本離心完畢后，傾倒出上清液體，并對(duì)細(xì)胞量少的離心管做標(biāo)記（在樣本轉(zhuǎn)移時(shí)將細(xì)胞量少的樣本全部倒入染色艙中）。⑥將離心管置于漩渦混合器上，震蕩混勻細(xì)胞沉淀塊30 s以上使其打散。

（2）制片染色。①將載玻片放置在制片染色室底板上并扣好制片染色艙，按順序?qū)μ?hào)放置好樣本離心管和吸嘴，在載玻片上標(biāo)注相應(yīng)編號(hào)，檢查試劑是否足夠。②開(kāi)啟制片染色機(jī)電源，設(shè)置自動(dòng)染色參數(shù),完成自動(dòng)染色程序。

（3）濕式封片。①制片結(jié)束后，依次拆除制片艙，將完成制片染色的樣片插入酒精缸（無(wú)水乙醇）中的玻片架上進(jìn)行脫水，時(shí)間約30 s；注意必須在玻片上液體未干前迅速放入酒精缸進(jìn)行脫水。②放入二甲苯內(nèi)透明約5 min以上。③中性樹(shù)膠濕式封片。

（4）按照TBS系統(tǒng)進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)判讀及規(guī)范化報(bào)告。

2.2 HPV分型檢測(cè)

2.2.1 HPV分型

核酸檢測(cè)及基因分型試劑是指利用PCR-熒光探針?lè)ǖ暮怂釞z測(cè)技術(shù)，以特定高危型HPV 核酸（包括DNA 和RNA）序列為檢測(cè)目的，對(duì)人宮頸樣本（如人宮頸脫落上皮細(xì)胞或分泌物等）進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑，以確定受試樣本中是否存在高于陽(yáng)性判斷值水平的高危型及低危型HPV 病毒，并同時(shí)鑒定感染HPV 的基因型別。

本研究采用北京博暉創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的博暉微流控全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)，一次可同時(shí)檢測(cè)24個(gè)樣本，檢測(cè)18+6=24個(gè)亞型分型。人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒（生物芯片法）與博暉公司生產(chǎn)的核酸芯片檢測(cè)儀（型號(hào)BHF-VI）配套使用。當(dāng)待測(cè)樣本加入到HPV檢測(cè)芯片加樣孔后，在微泵的驅(qū)動(dòng)下，分別進(jìn)行目的DNA的提取、針對(duì)目的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和反向斑點(diǎn)雜交。

2.2.2 博暉微流控全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)操作方法和步驟

（1）系統(tǒng)準(zhǔn)備。①檢查消耗品：試劑盒Ⅰ（冷凍試劑）、試劑盒Ⅱ（冷藏試劑）、試劑盒Ⅲ（常溫試劑）。②裝載槍頭：從試劑盒Ⅲ中取出槍頭盒→取出盒中槍頭架→放置儀器槍頭倉(cāng)中間位置→左右下壓卡住槍頭架→完畢。③清潔芯片膠墊：用膠帶輕輕粘除表面雜質(zhì)。④擺放芯片：將芯片從試劑盒Ⅲ中取出→去除外層包裝→將芯片擺放到對(duì)應(yīng)位置→扣壓鎖緊芯片→點(diǎn)擊軟件加載芯片。

（2）樣本的前期處理。①標(biāo)本瓶用旋渦混合器充分振蕩30 s以上，目的是將細(xì)胞刷上的細(xì)胞震落到保存液中，并且將黏液及血液震散。②標(biāo)本編號(hào)：準(zhǔn)確把芯片、申請(qǐng)單用條碼標(biāo)簽對(duì)應(yīng)貼好（或用記號(hào)筆標(biāo)注上相應(yīng)編號(hào)）。③用1 000 mL移液器，吸取0.2 mL樣本加入到芯片樣本艙中。

（3）項(xiàng)目程序運(yùn)行。①主頁(yè)面→INI 函數(shù)→模塊1、2 選擇檢測(cè)通道→加載試驗(yàn)→選擇加載INI 文件→加載成功右側(cè)出現(xiàn)運(yùn)行程序→點(diǎn)擊“Start HPV Run”。②檢查正負(fù)壓，及各通道溫度顯示。

2.2.3 結(jié)果判讀

根據(jù)博暉微流控全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀及規(guī)范化報(bào)告。

2.3 TCT細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果

低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（ASC-H、HSIL）的病例及不典型腺細(xì)胞（HGC）的病例；HPV分型檢測(cè)為高危型HPV（16型、18型、52型、58型、56型、31型、33型、及以上所列各型的不同混合型）感染的病例均轉(zhuǎn)診陰道鏡下取宮頸組織活檢，以組織病理學(xué)檢查結(jié)果為確診診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[4]。

3 結(jié)果與結(jié)論

高危型HPV感染與宮頸癌存在因果關(guān)系，且70%以上的宮頸癌并發(fā)高危型HPV16，HPV18的感染。HPV的檢出率和類(lèi)型因不同地區(qū)、不同標(biāo)本源以及不同的檢測(cè)方法而不同[5]。本研究對(duì)張掖市甘州區(qū)1 247例婦女篩查對(duì)象分別進(jìn)行HPV分型檢測(cè)和TCT細(xì)胞學(xué)檢查，結(jié)果見(jiàn)表1、表3，同時(shí)研究顯示高危型HPV感染的類(lèi)型和檢出率由高到低分別是HPV52，HPV56，HPV39，HPV16，HPV18,HPV58，HPV31/33/59/68，見(jiàn)表2。HPV分型檢測(cè)能夠早期、準(zhǔn)確檢測(cè)出是否存在高危型HPV病毒感染，從病因?qū)W方面做出診斷。TCT細(xì)胞學(xué)檢查則是從形態(tài)學(xué)層面上發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的特征性病變，特異性高，但由于TCT細(xì)胞學(xué)檢查需要人工閱片，對(duì)人員資質(zhì)和診斷水平有一定的要求，因人工閱片主觀因素的影響和細(xì)胞學(xué)醫(yī)師診斷水平的參差不齊存在一致性低，敏感性低，不易發(fā)現(xiàn)早期病變等弊端，本研究經(jīng)過(guò)對(duì)1 247例宮頸癌前病變篩查方案及檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比研究分析，HPV分型檢測(cè)與TCT細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合檢測(cè)對(duì)宮頸癌前病變的篩查更為有效、高效，其診斷符合率為92.86%，顯著高于TCT（81.25%）和HPV（52.00%）單獨(dú)對(duì)宮頸癌及癌前病變的診斷率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。

表1 1 247例HPV檢測(cè)結(jié)果情況

表2 119例高危HPV檢測(cè)陽(yáng)性中各型占比情況

表3 1 247例TCT檢測(cè)結(jié)果情況

表4 3種篩查方案結(jié)果對(duì)比

4 討論

目前TCT細(xì)胞學(xué)檢查和HPV高危病毒檢測(cè)都是國(guó)內(nèi)篩查宮頸癌前病變最常用的檢測(cè)方法。研究表明，高危型HPV病毒的持續(xù)性感染使女性患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)性增加，TCT和HPV檢測(cè)分別從細(xì)胞學(xué)形態(tài)與病因分子生物學(xué)水平對(duì)宮頸癌前病變進(jìn)行篩查，TCT細(xì)胞學(xué)檢查特異度高，但敏感度低，而高危型HPV檢測(cè)敏感度高卻特異度低，將二者檢測(cè)結(jié)合起來(lái)可以相互彌補(bǔ)其不足，有效提高篩查符合率。本研究對(duì)1 247例篩查者行宮頸癌前病變篩查,對(duì)比檢測(cè)結(jié)果與陰道鏡下組織活檢病理診斷結(jié)果，HPV分型檢測(cè)聯(lián)合TCT細(xì)胞學(xué)檢查的篩查方案與宮頸組織活檢病理診斷符合率高（92.86%），與以往檢測(cè)結(jié)果相吻合[6]。

綜上所述，聯(lián)合使用HPV分型檢測(cè)與TCT細(xì)胞學(xué)檢查可有效降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率及宮頸癌前病變過(guò)診和漏診率，有效提高宮頸癌前病變的篩查陽(yáng)性率和診斷的正確性，值得在婦女兩癌篩查及臨床宮頸癌及癌前病變篩查中廣泛應(yīng)用和推廣。