劉付英，楊水艷，郭 穎，邵志凌

（云南省糧油科學(xué)研究院（云南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心），云南 昆明 650033）

矮壯素（chlormequat，CCC），化學(xué)名為氯化氯代膽鹼或2-氯乙基三甲基氯化銨，是一種優(yōu)良的季銨鹽類植物生長調(diào)節(jié)劑，主要用于小麥、水稻、水果等作物[1-3]。近年來，由于植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中的大量使用以及可能導(dǎo)致的農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)發(fā)生變化，使得人們對植物生長調(diào)節(jié)劑的關(guān)注越來越高。研究表明[4]，即使在低于日允許攝入量（ADI）濃度水平下，矮壯素對動物的繁殖能力仍有不良影響。目前，歐盟、國際食品法典委員會（CAC）、日本等均對矮壯素在食品中的殘留量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)（表1）。2020年美國環(huán)保署發(fā)布了2020-10483和2020-10331號條例，修訂矮壯素在燕麥類中的殘留限量為40 mg/kg。我國現(xiàn)行的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）規(guī)定了谷物、油料和油脂2大類14小類中矮壯素的殘留限量和標(biāo)準(zhǔn)方法，限量為0.1～10 mg/kg，谷物按照《糧谷中矮壯素殘留量的測定》（GB/T 5009.219—2008）測定，油料和油脂參照該標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，主要采用氣相色譜質(zhì)譜法，檢出限為0.01 mg/kg。

表1 國內(nèi)外農(nóng)產(chǎn)品中矮壯素最大殘留限量Table 1 Maximum residue limits of chlormequat in agricultural products at home and abroad mg/kg

目前國內(nèi)外關(guān)于矮壯素的檢測方法主要有薄層色譜法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[7-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS[10-27]和離子色譜法[28]等，常用的前處理方法有直接萃取法[13,29-30]、固相萃?。⊿PE）法[17-20,23-24]、QuEChERS法[25-27,31-33]等。糧食谷物中矮壯素的檢測[7,18-19]主要采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法，前處理是固相萃取法（SPE）。SPE法凈化效果較好，操作簡單，但存在凈化方法相對單一、消耗時間等不足，難以滿足同時凈化理化性質(zhì)差異較大的多種化合物[34]。QuEChERS是一種新型分散固相萃取技術(shù)，是Quick（快速）、Easy（簡單）、Cheap（便宜）、Effective（高效）、Rugged（耐用）和Safe（安全）的縮寫，此方法主要是通過鹽析分層，利用基質(zhì)分散萃取原理，采用適當(dāng)?shù)奈絼┨盍希–18、PSA、GCB等）與干擾物結(jié)合，通過離心去除基質(zhì)（如色素、糖、脂肪等）干擾以達(dá)到凈化的目的。該方法具有快速、高效、經(jīng)濟(jì)、安全等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于各類食品檢測中。同時隨著色譜-質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，尤其是二級質(zhì)譜（MS/MS）相對一級質(zhì)譜（MS）來說，其抗干擾能力更強(qiáng)，對樣品前處理的要求更低，QuEChERS結(jié)合高靈敏度的色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析會帶來更好的測定效果。目前采用QuEChERS方法前處理測定糧食和油料油脂中矮壯素殘留的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法尚無相關(guān)研究報道。本工作結(jié)合谷物、油料和油脂其基質(zhì)和性質(zhì)的差異，以《糧谷中矮壯素殘留量的測定》（GB/T 5009.219—2008）方法為基礎(chǔ)，考察了氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件，衍生劑、提取溶劑、凈化劑等因素的影響，建立了QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GCMS/MS）測定糧谷和油料油脂中矮壯素殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

矮壯素甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）：安諾倫（北京）生物科技有限公司；乙腈、2-丁酮為分析純：國藥集團(tuán)有限公司；甲醇、無水硫酸鎂、氯化鈉為分析純：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；苯硫酚鈉（90%純度）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇（HPLC級）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；C18、PSA（40-60 μm）：天津博納艾杰爾科技有限公司；檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉為分析純、ZrO2珠：北京Ability公司。

1.2 儀器設(shè)備

TSQ9000三重串聯(lián)四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；XT-NS1全自動氮吹濃縮儀：上海新拓分析儀器科技有限公司；SiO-6512 QuEChERS-全自動樣品制備系統(tǒng)（配有渦流振動離心機(jī)、12位均質(zhì)離心轉(zhuǎn)子、均質(zhì)分離工作站）：北京本立科技有限公司；PM200行星式球磨儀：德國RETSCH（萊馳）公司；3100型-實驗?zāi)ィ喝鸬洳ㄍ▋x器公司；CD1仿工業(yè)實驗?zāi)シ蹤C(jī)：法國肖邦技術(shù)公司；JLG-II檢驗用礱谷機(jī)：中儲糧成都糧食儲藏科學(xué)研究所；JNM-III碾米機(jī)：中儲糧成都糧食儲藏研究院有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的制備

稻谷樣品經(jīng)礱谷機(jī)脫殼后用碾米機(jī)碾成大米，與玉米樣品通過波通磨進(jìn)行粉碎（80目）；小麥經(jīng)磨粉機(jī)制成小麥粉，大豆、油菜籽經(jīng)球磨儀粉碎。所有粉碎后的樣品裝入容器后密封，于0～4 ℃冷藏保存。

1.3.2 樣品前處理

分別稱取糧谷5.00 g、植物油2.00 g、油料3.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，依次加入 5 mL 水、ZrO2珠（24粒）、15 mL 乙腈、1.25 g氯化鈉、4.00 g無水硫酸鎂，裝入凈化內(nèi)管（含100 mg無水硫酸鎂、100 mg C18、100 mg PSA），放入SiO-6512主機(jī)中，按設(shè)定程序運(yùn)行（提取：2 000 r/min渦旋20 min，4 500 r/min離心5 min；凈化：2 000 r/min渦旋20 min，4 500 r/min離心5 min）。準(zhǔn)確移取2 mL內(nèi)管上清液，40 ℃氮吹至近干，加入1 mL質(zhì)量濃度2 mg/mL的苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液，60 ℃水浴中衍生30 min，冷卻混勻后過0.22 μm 有機(jī)濾膜，供GS-MS/MS測定。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

矮壯素標(biāo)準(zhǔn)工作液（5 mg/L）：精確移取矮壯素（100 mg/L）100 μL用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為5 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，用于質(zhì)譜工作條件的優(yōu)化和探索；取適量矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L），用甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：TG-5SILMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度 50 ℃，保持 1 min，以 8 ℃/min升溫至170 ℃，再以25 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min；載氣：氦氣（純度≥99.999%），流速：1.20 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1 uL。

質(zhì)譜條件：離子源：EI源；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；電子能量：70 eV；掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（SRM），矮壯素與苯硫酚鈉衍生物定量離子對136-135，碰撞電壓8 V；定性離子對 136-91，碰撞電壓 20 V；定性離子對135-65，碰撞電壓28 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用程序升溫條件，選擇 TG-5SILMS弱極性色譜柱，用質(zhì)量濃度為5 ug/mL的矮壯素衍生溶液，ESI+模式下對質(zhì)量數(shù) 50～500進(jìn)行全掃描（fullscan），選擇目標(biāo)化合物質(zhì)譜圖中 2個強(qiáng)度較大的碎片離子136，135作為母離子，逐步對子離子及碰撞能（CE）進(jìn)行優(yōu)化，最終確定能量最強(qiáng)、效果最優(yōu)的136-135作為定量離子對，碰撞電壓8 V；136-91為定性離子對，碰撞電壓20 V；135-65為定性離子對，碰撞電壓28 V，見圖1。在此條件下測定的矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物的離子圖見圖2。

圖1 不同離子對的碰撞電壓優(yōu)化曲線Fig.1 Optimization curve of collision voltage for different ion pairs

圖2 矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物的離子圖Fig.2 Ion chromatogram of chlormequat standard solution derivatives

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

矮壯素具有強(qiáng)極性，易溶于水、甲醇和乙腈等溶劑，常采用乙腈、酸化乙腈、甲醇水、甲醇-乙腈等溶劑提取，趙永信等[7]采用甲醇-乙腈（1∶4，v/v）混合溶液提取大米、玉米中的矮壯素，固相萃取法凈化，回收率達(dá)到62.0%～91.6%；曹慧[7]等用甲醇-水-乙酸（22∶77∶1，v/v/v）混合溶液提取大米、玉米、小麥等樣品的矮壯素，固相萃取小柱凈化，回收率為77.7%～93.1%。考慮矮壯素的極性和溶解性，本工作以小麥粉、大米、大豆、菜籽油為基質(zhì)樣品，添加0.5 ug/kg的矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較了乙腈、甲醇-乙腈（1∶4，v/v）、甲醇-乙腈（1∶1，v/v）、甲醇-乙腈（4∶1，v/v）、甲醇的提取效果，如圖4所示，結(jié)果顯示乙腈和甲醇-乙腈（1∶4，v/v）作為提取溶劑時，矮壯素的提取效率較好，回收率均大于80%，且提取液雜質(zhì)較少。隨著提取溶劑中甲醇量的增加，提取液中的干擾物變多，溶液變得混濁，提取效率也較低，原因可能是乙腈比甲醇有更好的除蛋白效果，綜合考慮本工作選擇乙腈作為提取溶劑。

圖3 矮壯素在不同基質(zhì)樣品和不同提取溶劑中的提取效率Fig.3 Extraction efficiencies of the CCC in different matrix samples and different extraction

圖4 不同吸附劑對矮壯素基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.4 Effect of different adsorbent on matrix effect of CCC (n=3)

2.2.2 提取方式的優(yōu)化

QuEChERS法由美國學(xué)者 ANASTASSIADES等[35]于 2003年首次提出，是一種針對蔬菜水果中多組分農(nóng)藥殘留的凈化。由于蔬菜水果的含水量較大，當(dāng)樣品含水量小于25%時，需在處理過程中加入水來增加細(xì)胞的通透性，以提高樣品在提取過程中農(nóng)藥殘留的析出。本工作研究了小麥粉樣品中矮壯素添加水平為0.5 mg/kg時加水量不同及加水后不同操作的提取效果。受SiO-6512主機(jī)對提取管量程限制，實驗討論了樣品處理中不加水、加2 mL和5 mL水，其他步驟按1.3.2操作矮壯素的提取效率，結(jié)果顯示，不加水矮壯素的提取效率較低，回收率在20%左右，加5 mL水矮壯素的提取效率要優(yōu)于加2 mL水的。加水后不同的操作：方式1樣品加水后渦旋振蕩2 min，靜置30 min后按1.3.2操作，結(jié)果顯示矮壯素基本沒有提取出來。方式2樣品加水后立即按1.3.2操作，矮壯素的回收率可以達(dá)到80%以上。加水后靜置與否對矮壯素回收率影響較大，主要原因是矮壯素具有強(qiáng)極性、易溶于水，在加水靜置的過程中，矮壯素已經(jīng)溶于水中，后續(xù)加入乙腈萃取時，矮壯素在有機(jī)相中的分配較差，導(dǎo)致回收率偏低。

2.2.3 凈化方式的優(yōu)化

糧谷中含有大量蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪，油料和油脂主要由脂肪酸甘油酯組成，在凈化過程中需盡可能地除去基質(zhì)中的這些干擾物。本工作基于糧食和油料油脂高脂肪、高蛋白的基質(zhì)特點，對QuEChERS方法進(jìn)行了優(yōu)化，通過調(diào)整不同吸附劑及其用量從而達(dá)到對目標(biāo)物有最優(yōu)的提取凈化效果。QuEChERS方法中常用的吸附劑主要有C18、PSA、GCB等，鑒于糧谷和油料油脂類樣品的基質(zhì)，GCB價格昂貴等因素，本工作未對GCB吸附劑進(jìn)行研究，重點研究了 C18和 PSA及其C18+PSA組合（含100 mg無水硫酸鎂）的凈化效果，并結(jié)合基質(zhì)效應(yīng)對吸附劑含量進(jìn)行了優(yōu)化。本工作在空白小麥粉、大米、油菜籽、菜籽油樣品中添加0.5 mg/kg矮壯素，加入不同質(zhì)量吸附劑的實驗結(jié)果見圖 5。PSA+C18組合凈化效果較好，優(yōu)于單個吸附劑使用時的效果，對于大米、小麥粉樣品，當(dāng)PSA+C18的質(zhì)量為50 mg+100 mg時，凈化效果最佳，基質(zhì)效應(yīng)隨 PSA、C18含量的增加并沒有明顯的變化；當(dāng)PSA+C18的質(zhì)量為100 mg+100 mg時，油菜籽、菜籽油的凈化效果最佳，提取液幾乎為無色，色譜圖中雜峰較少，增加PSA+C18的質(zhì)量其基質(zhì)效應(yīng)并沒有明顯的變化。上述實驗結(jié)果顯示，PSA+C18組合已能夠有效去除提取液中脂肪、色素等干擾物，并能有效降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。綜合考慮樣品基質(zhì)、儀器污染、去除雜質(zhì)效果等因素，本工作選擇100 mg C18+100 mg PSA（含100 mg無水硫酸鎂）的組合作為QuEChERS的凈化吸附劑。

2.2.4 衍生條件的優(yōu)化

矮壯素為季胺鹽類化合物，極性高不容易氣化，無法直接進(jìn)行氣相色譜分析，需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)。矮壯素衍生化使用的試劑有苯硫酚鈉[7]和五氟代苯硫酚鹽[8]，其與苯硫酚鈉的衍生物為苯基乙烯基硫醚，通過測定揮發(fā)物苯基乙烯基硫醚的含量確定樣品中矮壯素的殘留量?！都Z谷中矮壯素殘留量的測定》（GB/T 5009.219—2008）方法是在氮氣環(huán)境下加入2 mL 6 mg/mL的苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液，于80 ℃下反應(yīng)30 min，然后用 GC/MS進(jìn)行定性、定量分析。本工作比較了 2.0、4.0、6.0 mg/mL苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液各1 mL在60、70、80 ℃下反應(yīng)30、40、50 min對0.5 μg/mL矮壯素標(biāo)準(zhǔn)工作液的衍生效果。

通過正交實驗結(jié)果分析（表2），以2.0 mg/mL苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液在60 ℃下衍生30 min效果最佳。當(dāng)苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液濃度大于2.0 mg/mL時，衍生反應(yīng)的產(chǎn)率變化不大，但苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液濃度越高對色譜柱及離子源污染越大。在60 ℃反應(yīng)30 min衍生反應(yīng)已基本完成，隨著時間和溫度的增加，衍生產(chǎn)物的產(chǎn)率無明顯變化。故本工作確定衍生化條件為提取液中加入1 mL質(zhì)量濃度2.0 mg/mL苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液，在60 ℃下反應(yīng)30 min，衍生劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

表2 矮壯素衍生化正交實驗Table 2 Orthogonal experiment of derivatization of CCC

方法的不足和局限性：矮壯素與苯硫酚鈉/2-丁酮懸濁液在衍生過程中生成的干擾產(chǎn)物較多，見圖 5。衍生劑之間、衍生劑與試劑之間會相互反應(yīng)，生成產(chǎn)物的干擾會降低被測目標(biāo)物的靈敏度。另外衍生目標(biāo)物不包含矮壯素的特征結(jié)構(gòu)，其他季銨鹽類物質(zhì)也可能發(fā)生脫烷基化反應(yīng)得到相同的衍生產(chǎn)物，該方法對矮壯素不具有特異性，當(dāng)樣品中存在性質(zhì)相近的組分時，定量分析的準(zhǔn)確度無法保證。

圖5 矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生反應(yīng)的主要副產(chǎn)物質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of main byproducts in derivative reaction of chlormequat standard solution

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在進(jìn)行離子化時相互競爭而導(dǎo)致目標(biāo)化合物信號強(qiáng)度有不同程度的增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)[36-37]。目標(biāo)物和樣品本身的性質(zhì)均會影響其基質(zhì)效應(yīng)，而基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)物定量與定性的準(zhǔn)確性也會有影響，因此對基質(zhì)效應(yīng)的評估非常必要。本工作采用基質(zhì)中矮壯素衍生物響應(yīng)值與純?nèi)軇┲邪珘阉匮苌镯憫?yīng)值的比值ME來進(jìn)行，即ME=（基質(zhì)中矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物的峰面積/溶劑中矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物的峰面積）×100%[38]。小麥粉、大米、玉米、大豆、大豆油、油菜籽、菜籽油空白樣品采用 1.3.2處理，用基質(zhì)分別配制0.5 μg/mL的矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察矮壯素的基質(zhì)效應(yīng)。ME大于1為增強(qiáng)效應(yīng)，ME小于1為抑制效應(yīng)，結(jié)果顯示，矮壯素在不同基質(zhì)樣品中均呈現(xiàn)不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME在 78.2%～98.4%之間。ME在 0.8～1.2時，通常認(rèn)定為弱基質(zhì)效應(yīng)。除菜籽油外，其余樣品的基質(zhì)效應(yīng)均超過80%，為弱基質(zhì)抑制效應(yīng)。菜籽油可能是因為其基質(zhì)中所含的色素、脂肪等內(nèi)源性物質(zhì)對檢測結(jié)果有較大的干擾，表現(xiàn)為中等基質(zhì)抑制效應(yīng)，本工作主要通過配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾[39]。

2.4 線性范圍、定量限和檢出限

以矮壯素衍生物的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），矮壯素衍生物定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同基質(zhì)中矮壯素衍生物在0.05～2.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，R2均大于0.998，結(jié)果見表3。

通過加標(biāo)回收實驗，向空白樣品中添加不同水平濃度的矮壯素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2方法對不同樣品進(jìn)行前處理，以最低添加濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，分別以信噪比（S/N≥3）和信噪比（S/N≥10）計算方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），如表 3所示，矮壯素在不同基質(zhì)下的 LOD為 0.004～0.006 mg/kg，LOQ為0.01～0.03 mg/kg。

表3 矮壯素在不同基質(zhì)中的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 3 Linear relationships, LODs, and LOQs of CCC in different matrices

2.5 回收率與精密度

取7種陰性研究樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，加標(biāo)水平分別為0.02、0.1、0.5 mg/kg，每個添加水平進(jìn)行6次實驗結(jié)果見表4。矮壯素的平均回收率在 73.6%～99.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在 2.34%～7.78%。方法的準(zhǔn)確度和回收率完全滿足實驗室質(zhì)量控制理化檢測中對回收率和精密度要求。

表4 不同基質(zhì)中矮壯素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 4 Spiked recoveries and RSDs of CCC in different matrices (n=6) %

2.6 樣品的檢測

隨機(jī)選取 45份市售及扦取的庫存糧食及油料油脂樣品，小麥粉6份、大米10份、玉米10份，大豆3份、油菜籽3份、大豆油5份、菜籽油8份進(jìn)行矮壯素殘留檢測。結(jié)果顯示，有2份玉米樣品中檢出矮壯素，結(jié)果為 0.65 mg/kg和1.08 mg/kg，檢出值低于國家標(biāo)準(zhǔn)對其規(guī)定的最大殘留限量，其余樣品均未檢測出矮壯素。

3 結(jié)論

本研究通過完善優(yōu)化國標(biāo)方法中對糧食和油料油脂中矮壯素殘留前處理及測定條件，建立了QuEChERS-GC-MS/MS法測定糧谷和油料油脂中矮壯素殘留的分析方法，該方法高效、靈敏度高，線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足方法學(xué)對不同指標(biāo)的要求。通過采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，能較大程度地消除基質(zhì)干擾，且方法的定量限完全滿足不同國家和組織對矮壯素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的要求，可為糧食和油料油脂中矮壯素殘留的檢測提供具體有效的方法技術(shù)參考。