張仕杰 陳鑫林 陳 于 白曉倩 趙玉強(qiáng) 王 武 朱燦燦* 陸小美

（1江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇南京 210014；2常州果美農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇常州 213245）

薄殼山核桃（Carya illinoinensis（Wangehn.） K.Koch）為胡桃科山核桃屬植物，原產(chǎn)美國(guó)和墨西哥，是世界上重要的油料干果樹種之一，極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)潛力[1]。目前，我國(guó)已在江蘇、安徽、浙江、云南等省大面積推廣種植薄殼山核桃[2]。隨著薄殼山核桃種植面積的不斷增加，種植園肥水管理等技術(shù)滯后，出現(xiàn)了果園低產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)效益差等制約薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題[3]。從高效、環(huán)保、節(jié)約成本的角度出發(fā)實(shí)施科學(xué)合理施肥，提高肥料利用效率，促進(jìn)薄殼山核桃快速生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量，是目前薄殼山核桃生產(chǎn)亟待解決的問題[4]。利用促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)高效吸收的微生物進(jìn)行生物施肥，是改善過量施肥造成的土壤環(huán)境惡化問題的最可行途徑，也是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[5]。

薄殼山核桃可與多種外生菌根真菌形成共生關(guān)系[6]。菌根是普遍存在于植物根系和土壤真菌之間的互惠共生體，兩者在長(zhǎng)期共生過程中互利共生、協(xié)同進(jìn)化[7]。菌根共生的最普遍類別之一是外生菌根，外生菌根真菌在增強(qiáng)樹木根系對(duì)水分及氮、磷等礦質(zhì)元素的吸收、改良土壤結(jié)構(gòu)、提高抗逆性和生產(chǎn)力等方面具有重要作用[8]。

有研究表明，外生菌根真菌接種結(jié)合氮磷鉀施肥有利于薄殼山核桃樹體生長(zhǎng)以及薄殼山核桃結(jié)實(shí)率的提高[9]。通過對(duì)感染腐霉菌根腐病的薄殼山核桃根部接種大孢硬皮馬勃菌，發(fā)現(xiàn)根部腐霉菌數(shù)量明顯減少[10]。因此，外生菌根在促進(jìn)薄殼山核桃生長(zhǎng)發(fā)育和提高抗逆性方面具有重要作用。目前，外生菌根真菌對(duì)薄殼山桃生長(zhǎng)的影響研究仍存在較大不足。因此，本研究以薄殼山核桃實(shí)生苗為試驗(yàn)對(duì)象，探討外生菌根真菌接種對(duì)薄殼山核桃幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為利用外生菌根真菌提高薄殼山核桃生長(zhǎng)樹勢(shì)、促進(jìn)薄殼山核桃增產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

薄殼山核桃波尼品種的種子經(jīng)萌發(fā)、生長(zhǎng)至子葉期（苗齡45 d）移入根箱進(jìn)行外生菌根真菌接種。接種方法參考Zhang等[11]的方法，即將薄殼山核桃幼苗移栽于根際盒中，然后將新鮮并具活力的菌絲塊（2cm×2cm）貼于薄殼山核桃幼苗根系進(jìn)行接種培養(yǎng)。對(duì)照苗用無菌瓊脂塊代替。所有幼苗均在氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（16 h，25℃光照培養(yǎng)；8 h，23℃黑暗培養(yǎng)）。

供試外生菌根菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存的外生菌根真菌土生空?qǐng)F(tuán)菌（Cenococcum geophilum，Cg）和豆馬勃屬（Pisolithus sp.，PS）。外生菌根真菌菌絲保存在MMN培養(yǎng)基中[11]，25℃黑暗培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

薄殼山核桃外生菌根苗（成功接種菌種Cg和PS，3個(gè)月苗齡）以及對(duì)照苗（3個(gè)月苗齡）被用于后續(xù)試驗(yàn)。采用盆栽試驗(yàn)（盆高16 cm，直徑18 cm），設(shè)置未接種的對(duì)照組和接種外生菌根真菌Cg和PS的處理組。每盆移栽1株苗，各處理分別重復(fù)3盆。培養(yǎng)基質(zhì)（蛭石和珍珠巖的混合物、田園土壤、草炭按3∶2∶1混合，每盆 1 200 g）經(jīng)過高壓滅菌（121 ℃，180 min）。盆栽苗培養(yǎng)在半封閉避雨設(shè)施場(chǎng)地內(nèi)，每隔3～4 d用自來水澆灌1次（達(dá)到田間最大持水量）。植株經(jīng)6個(gè)月生長(zhǎng)后測(cè)定光合指標(biāo)，然后收獲，分別測(cè)定薄殼山核桃幼苗葉片含水率，地上莖、干樣重量，地下菌根侵染率和根系的干樣重量。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 光合指標(biāo)。利用LI-6800光合-熒光測(cè)量系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司），于幼苗收獲前的晴朗天氣，分別測(cè)定對(duì)照區(qū)和菌根處理區(qū)植株的光合性能參數(shù)，測(cè)定環(huán)境為試驗(yàn)基地自然環(huán)境，選擇熒光葉室（葉室面積 2×3 cm2），氣體流速為 500 μmol/s，濕度控制為55%，采用CO2鋼瓶將CO2濃度控制為400μmol/mol，測(cè)定葉室溫度控制為28℃，測(cè)定光照度設(shè)置為1 500 μmol/（m2·s）。 測(cè)定時(shí)間為上午 8：30—11：30。每株幼苗選擇長(zhǎng)勢(shì)良好且具有代表性的葉片3片進(jìn)行測(cè)定，然后求其平均值。測(cè)定參數(shù)包括凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、胞間 CO2濃度（Ci）及氣孔導(dǎo)度（Gsw）。

參考陳雅琦等[12]的公式計(jì)算氣孔限制值（Ls），計(jì)算公式如下：

式中，Ca為大氣CO2濃度，本研究CO2濃度控制為 400 μmol/mol。

參考鄒英武等[13]的公式計(jì)算水分利用率（WUE）。計(jì)算公式如下：

1.3.2 地上生物量。將收獲的薄殼山核桃幼苗地上部和地下部分開，待地上部葉片鮮重測(cè)定后，將地上莖葉放入烘箱（60℃），干燥48 h后測(cè)定干重。葉片含水率計(jì)算公式如下：

葉片含水率（%）=（葉片鮮重-葉片干重）/葉片鮮重×100

1.3.3 地下生物量。分別隨機(jī)選取對(duì)照和外生菌根真菌侵染苗的10條側(cè)根，在體式顯微鏡下（光學(xué)顯微鏡LIOO SZ850）進(jìn)行菌根的觀察計(jì)數(shù)（平均計(jì)數(shù)根尖1 200個(gè)左右）。菌根計(jì)數(shù)觀察后，將地下根系60℃干燥48 h后確定地下根系干重。菌根侵染率計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 365和R 4.0.2（Window 10 64位）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用配對(duì)t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性（P<0.05）檢驗(yàn)，P值采用Benjamini-Hochberg法進(jìn)行矯正。采用GraphPad Prism 8繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種外生菌根真菌對(duì)薄殼山核桃光合作用的影響

由表1可知，與對(duì)照相比，接種外生菌根處理的薄殼山核桃幼苗凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gsw）均顯著提高（P<0.05），但胞間 CO2濃度（Ci）無顯著差異。 水分利用效率（WUE）方面，雖然在數(shù)值上高于對(duì)照，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，氣孔限制值（Ls）在數(shù)值上雖然低于對(duì)照，但也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同處理薄殼山核桃幼苗光合特性參數(shù)

2.2 接種外生菌根真菌對(duì)薄殼山核桃幼苗生物量的影響

由圖1可知，相較于對(duì)照，接種外生菌根處理可顯著提高薄殼山核桃幼苗的地上莖葉干重和葉片含水率。其中，Cg接種處理地下根系干重和植株地徑也顯著高于對(duì)照和PS接種處理（P<0.05）。由圖2可知，PS接種處理根冠比顯著低于Cg接種處理和對(duì)照。由此說明，不同外生菌根真菌對(duì)根系生長(zhǎng)的影響存在差異。

2.3 不同菌種菌根侵染率

顯微鏡下檢測(cè)顯示，所有未接種的對(duì)照盆中均沒有發(fā)現(xiàn)菌根。接種處理的根系均觀察到典型的外生菌根外觀形態(tài)結(jié)構(gòu)。PS接種處理菌根侵染率（65.5%）顯著高于Cg接種處理菌根侵染率（28.1%）（P<0.05）。通過觀察發(fā)現(xiàn)，PS接種處理菌根主要形成于幼嫩新根處，并且附著大量的根外菌絲以及菌索；Cg接種處理菌根主要形成于老根處，根外菌絲呈頭發(fā)狀稀疏發(fā)散，但沒有PS接種處理豐富。

3 結(jié)論與討論

薄殼山核桃是重要的經(jīng)濟(jì)林樹種，也是典型的外生菌根真菌共生樹種[6]。菌根真菌是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的功能菌群之一，外生菌根真菌在森林生態(tài)系統(tǒng)中分布極其廣泛，它們可通過促進(jìn)宿主植物對(duì)土壤礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素和水分等的吸收來促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)提高植物抗旱、抗鹽脅迫的能力[7，14]。本研究通過在薄殼山核桃幼苗根系上接種外生菌根真菌，結(jié)果表明，外生菌根真菌對(duì)薄殼山核桃幼苗生長(zhǎng)有不同程度的促進(jìn)作用，這和外生菌根真菌在其他樹種上的研究結(jié)果一致[11，15]。但何種菌根真菌與薄殼山核桃是最佳組合，以及最優(yōu)外生菌根真菌的篩選還有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，菌根侵染率較低的Cg接種處理反而可顯著提高宿主薄殼山核桃幼苗地上生物量，地下根系生物量也顯著高于對(duì)照苗和PS接種苗，表明不同外生菌根真菌菌種的促生特性存在差異。外生菌根植物的資源交換被認(rèn)為發(fā)生在菌體與植物的界面上，而資源交換是促使菌根植物生長(zhǎng)的主要原因。但一些研究結(jié)果表明，越來越多這種強(qiáng)化植物生長(zhǎng)，特別是根系生長(zhǎng)的促進(jìn)，可能與根系定植率無關(guān)。Szuba等[16]研究表明，盡管根定植率很低（2.1%±0.3%），外生菌根真菌卷緣樁菇（Paxillus involutus）仍顯著促進(jìn)了白楊（Populus×canescens）的生長(zhǎng)。不同外生菌根真菌為宿主提供營(yíng)養(yǎng)的能力可能會(huì)有所不同，目前已經(jīng)明確外生菌根真菌在吸收氮和磷的能力上有很大差異[17]。外生菌根的功能多樣性及其深層次的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。深入研究不同菌種對(duì)薄殼山核桃生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其作用機(jī)制，將會(huì)成為后續(xù)薄殼山核桃菌根研究的一個(gè)重要方向，也為利用外生菌根真菌促進(jìn)薄殼山核桃產(chǎn)業(yè)綠色生態(tài)優(yōu)質(zhì)發(fā)展提供理論依據(jù)。