武博瓊， 崔東遙， 焦仁和， 宋堅， 湛垚垚， 常亞青

（大連海洋大學水產與生命學院，農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

全球變暖（global warming）是指因溫室效應而造成溫度上升的氣候變化現(xiàn)象[1]。就占地球表面積71%的海洋而言，海洋升溫（ocean warming）和海洋酸化（ocean acidification）是全球變暖引發(fā)的主要不良現(xiàn)象[2-3]。據聯(lián)合國政府間氣候變化專門委員會（Intergovernmental Panel on Climate Change，IPCC）的預測模型推測，到2100年，海洋表面溫度將升高1.8～4.0 ℃，而海水表層pH 將下降至7.8 左右。調查顯示，自20 世紀90年代初以來，海洋變暖的速度增加了一倍，其中，2020年海水平均溫度是現(xiàn)代海洋觀測記錄以來最高的一年[4]。此外，野外研究證實，目前全球海水酸化的實際速度遠高于工業(yè)革命前2 500萬年間海水pH的自然變化幅度[5-7]。海水是海洋生物賴以生存的重要介質。研究證實，海洋升溫和酸化會對海洋生物的生長、繁殖、發(fā)育、代謝、群體規(guī)模甚至食物鏈產生復雜而深刻的影響[8]，其中，對海洋生物能量代謝的影響逐漸成為近年來的關注熱點。

己 糖 激 酶（hexokinase，HK）是 糖 酵 解（glycolysis）過程的第1個限速酶，是生物體能量收支的重要調控開關[9]，研究證實，己糖激酶的活力常受到環(huán)境因素的干擾。汝玉濤[10]研究發(fā)現(xiàn)，長光照培育下的柞蠶（Antheraea pernyi）蛹脂肪體中的己糖激酶活力呈上升趨勢，為蛹蛻皮過程提供更多的能量。朗德鵝（Anser anser）在填飼后期肝臟中HK基因的相對表達顯著增加，可促進葡萄糖向脂肪酸轉化，加快脂肪肝的形成[11]。在海洋生物研究領域，馬氏珠母貝（Pinctada martensii）HK基因在低溫脅迫條件下的相對表達呈先上升后下降的趨勢，表明HK基因可能參與馬氏珠母貝對低溫脅迫的響應過程[12]。郭彪等[13]研究顯示，凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）在溫度驟升時，肝胰腺中的HK 酶活力先升高后恢復至起始水平，表明凡納濱對蝦可能通過調控HK 酶活力以適應急性高溫脅迫。但是，目前就棘皮動物HK基因對海洋環(huán)境變化響應規(guī)律及模式的研究尚未見報道。

為研究棘皮類動物中HK基因的序列信息和表達規(guī)律，初步了解環(huán)境變化對棘皮動物體內HK基因表達及酶活力的影響，本研究以寒溫帶海膽種類——中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）為研究對象，利用cDNA 末端快速擴增（rapidamplification of cDNA ends, RACE）技術獲得中間球海膽HK基因的全長cDNA 序列（SiHK）并利用生物信息學軟件分析其序列特征。腸和性腺組織擔負著海膽食物消化、生殖和儲能等重要功能[14]，且性腺是有較高營養(yǎng)價值的可食用部位，研究表明，海膽性腺中多不飽和脂肪酸含量占總脂肪酸含量的54.1%[15]。因此，本研究重點研究高溫-酸化脅迫下，中間球海膽性腺和腸組織中SiHK基因的相對表達量以及總SiHK酶活力的變化，為深入研究棘皮動物體內HK基因的生物學功能提供基礎數(shù)據和參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以中間球海膽為研究對象，購自大連旅順龍王塘養(yǎng)殖場，隨機選取240 只平均殼徑（3.5±0.1）cm、平均體質量（20.2±2.5）g 且健康、活力較好的海膽，于農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室暫養(yǎng)7 d 后開始試驗。暫養(yǎng)期間在自然海水條件下進行養(yǎng)殖，投喂海帶（Saccharina japonica），每隔2 d進行1次全量換水。

選擇平均體質量（25.4±3.3）g 且健康、活力好的中間球海膽，于冰上取管足、圍口膜、齒間肌、體腔液、腸和性腺6個組織，做好標記后，在液氮中迅速冷凍，凍存于-80 ℃，用于后續(xù)的基因克隆和組織表達分析。

1.2 試驗設計

按照參考文獻[16]的方法對海水進行酸化處理。根據 IPCC 對海洋 2100年 pH 的預測[17]，試驗以自然海水為對照（CK），設置3個試驗組，試驗組分別為高溫海水組（HC，ΔT=+3.0 ℃）、酸化海水組（LO，Δ pHNBS=-0.5）和高溫酸化海水組（HO，ΔT=+3.0 ℃，ΔpHNBS=-0.5）。每個試驗組設置6 次平行組，每個平行組10只海膽。試驗期間，利用pH計（PH838，SMART，中國香港）和水質儀（YSI6 920，YSI，美國）實時監(jiān)測各試驗組海水的pHNBS、鹽度和溫度?？倝A度(total alkalinity，TA)依據pH 滴定法進行測定。運用SWCO2 軟件(http://neon.otago.ac.nz/research/mfc/people/keith_hunter/software/software.htm/)根據測定的海水pH、鹽度、溫度和總堿度計算出各組二氧化碳分壓（partial pressure of carbon dioxide，pCO2）。

試驗持續(xù)60 d，期間各試驗組海水參數(shù)如表1所示。試驗期間，每天投喂海帶1次，日換水量為總水量的1/2，每2 d進行1次全量換水，換水時及時清除殘餌及糞便；為避免海水pH的劇烈波動，換水前后需對溫度、pHNBS、鹽度、總堿度和二氧化碳分壓等海水參數(shù)進行檢測，待穩(wěn)定后再開始試驗。

表1 各試驗組的海水參數(shù)Table1 Seawater parameters of each treatment

1.3 中間球海膽SiHK基因克隆

按照RNA 提取試劑盒（普洛麥格公司）說明書提取中間球海膽各組織中的總RNA。5’RACE及 3’RACE 的反轉錄參照 Smarter RACE cDNA 試劑盒（Clontech，美國）說明書進行，獲得cDNA 模板，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根據中間球海膽轉錄組文庫獲得SiHK基因的核心片段和引物設計原則，使用Primer Premier 5.0 軟件設計引物（表2）。PCR 擴增體系（10 μL）：含有1 μL cDNA，上下游引物各0.4 μL，Buffer 1 μL，LA-Taq酶0.2 μL，dNTP 0.8 μL，ddH2O 6.2 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切取目的條帶，使用柱式DNA 膠回收試劑盒（生工生物工程，上海）進行回收。將回收的PCR 產物與pEASY?-T1 克隆載體（全式金，北京）連接，轉化到Trans1-T1 噬菌體抗性的感受態(tài)細胞（全式金，北京）中；向轉化后的感受態(tài)細胞中加入含0.1%氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃搖菌培養(yǎng)1 h 后，涂平板，于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h，挑取單一菌落至LB 液體培養(yǎng)基中繼續(xù)擴大培養(yǎng)；取1 μL 培養(yǎng)的菌液為模板，通過菌落PCR 篩選陽性克隆，送至生工生物工程上海有限公司進行測序。

1.4 中間球海膽SiHK序列的生物信息學分析

利用DNAMAN 6.0軟件對獲得的中間球海膽SiHK基因的3’和5’端序列與核心片段序列進行拼接組裝，最終得到SiHK基因的全長cDNA 序列。利用 BLAST（BLASTX，http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對SiHK基因核苷酸及其所編碼氨基酸序列進行相似性分析；使用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）軟件確定SiHK基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）；利用 EXPASY Proteomics Server（http://www.expasy.org）軟件對SiHK基因編碼的蛋白序列進行理化性質分析；利用SMART（http://smart.emblheidelberg.de/）和 PSIRED v3.3（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）軟件預測SiHK 蛋白質的結構域和二級結構；利用SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預測SiHK 蛋白質的三維結構；應用DNAMAN 6.0 軟件對SiHK基因編碼的氨基酸序列進行多序列比對；利用MEGA 7.0 軟件，基于鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建15種生物HK氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。

高校應加強對就業(yè)指導模式的改革與創(chuàng)新。高校的任務不僅是讓學生獲得知識，也應保障學生職業(yè)生涯的良好發(fā)展，這符合學生和學校共同的利益。構建學生高校命運共同體，能讓學校切實重視學生就業(yè)能力的提升工作，將就業(yè)指導深化、細化。同時，應針對不同階段的學生實施不同的就業(yè)指導內容和指導方式，幫助學生進行職業(yè)認知、職業(yè)選擇與職業(yè)規(guī)劃，為學生提供完善的就業(yè)服務。

1.5 qRT-PCR 檢測中間球海膽SiHK 基因的相對表達規(guī)律

采用LightCycler96 實時熒光定量PCR 儀（Roche Life Science，德國）進行qRT-PCR，反應程序為三步法擴增反應，具體參照說明書進行。從實驗室前期獲得的中間球海膽轉錄組文庫中篩選出目的基因的核心片段，利用Premier 5 設計引物（表2），選用在中間球海膽組織中穩(wěn)定表達的β-actin作為內參基因，并對引物的特異性和擴增效率進行檢測。反應體系（20 μL）：2 μL cDNA，上下游引物各 0.8 μL，2×SYBR?PremixEx TaqTMⅡ 10 μL，ddH2O 6.4 μL。熒光定量 PCR 反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；反應后進行熔解曲線分析，以排除非特異性擴增的污染。采用 2-ΔΔCT法[19]計算SiHK基因的相對表達量。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.6 中間球海膽組織總SiHK酶活力測定

分別取中間球海膽性腺和腸組織樣品各1.0 g，液氮研磨后，按1∶9（質量體積比）加入無菌海水，4 ℃、2 500 r·min-1離心10 min后留取上清液。

總蛋白含量的測定按照總蛋白（total protein，TP）測定試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所，南京）進行，將樣品和所加試劑混勻，靜置10 min，于 595 nm 處，1 cm 光徑，雙蒸水調零，測定各管吸光值（OD 值）。計算公式如下,標準品質量濃度為 0.563 g prot·L-1。

總SiHK 酶活力的測定按照已糖激酶試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所，南京）進行，利用Epoch 酶標儀（Biotek,美國）測定反應底物吸光值，根據說明書中公式，記錄在340 nm波長下20 s時的初始吸光度A1 和320 s 時的吸光度A2，計算公式如下。

式中，ε 為 NADH 在 340 nm 處摩爾吸光系數(shù)（6.22×103L·mol-1·cm-1）；d為比色皿光徑（cm）；V反總為反應體系總體積（L）；Cpr為上清液蛋白質質量濃度（mg·mL-1）；V樣為加入反應體系中上清液體積（mL）；T為催化反應時間（min）。

1.7 數(shù)據分析處理

采用Excel 2016 和Origin 8.0 進行數(shù)據整理和圖表繪制，采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 中間球海膽SiHK基因的全長cDNA序列

如圖1 所示，中間球海膽SiHK基因的cDNA序列全長2 041 bp，編碼476個氨基酸，起始密碼子（ATG）位于序列的第103 堿基處，終止密碼子（TGA）位于序列的第1 533 堿基處。生物信息學分析結果顯示，SiHK基因編碼蛋白（SiHK）的理論等電點（pI）為6.44，蛋白分子質量52.72 kD。二級結構預測顯示（圖2），SiHK 的氨基酸序列中含有 COG5026 結構域，共包含 17個 α-螺旋、13個β-折疊和31個無規(guī)則卷曲，相對于仿刺參HK 的二級結構，中間球海膽和紫球海膽（Strongylocentrotus purpuratus）的 HK 在二級結構上更為相似，2 種海膽蛋白序列中存在43個氨基酸殘基的差異，中間球海膽SiHK 蛋白序列較紫球海膽HK 蛋白序列多1個無規(guī)則卷曲、少1個α-折疊。三維結構預測顯示（圖3），SiHK 與人（Homo spains）HK 蛋白（PDB 登錄號：1cza.1）的相似性為43.34%，具有較為相似的三維結構，存在2個磷酸基團識別位點及其與周圍蛋白構成的酶活性中心，磷酸基團識別位點與蛋白質通過鹽橋相連接。

圖1 中間球海膽SiHK的核苷酸序列及其所編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of SiHK in Strongylocentrotus intermedius

圖2 中間球海膽SiHK二級結構預測及其與紫球海膽、仿刺參HK的二級結構比較Fig.2 Secondary structure prediction and comparison of hexokinase between

圖3 中間球海膽SiHK蛋白質的三級結構Fig.3 3D structure prediction of SiHK

圖4 中間球海膽SiHK氨基酸序列系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of deduced amino acid sequences of SiHK

2.2 中間球海膽SiHK基因的組織表達及酶活力

2.2.1SiHK基因表達和酶活力 如圖5 所示，SiHK基因在6 種中間球海膽組織中均有表達，且具有較為明顯的組織特異性，其相對表達量由高到低依次為：性腺＞腸＞齒間肌＞圍口膜＞管足＞體腔液，其中，SiHK基因在中間球海膽性腺組織中的相對表達量最高，在腸組織中的相對表達量次之，而在體腔液中的相對表達量最低。

酶活力檢測結果（圖5）顯示，6 種中間球海膽組織中的總SiHK 酶活力差異較大，其中，在體腔液中總SiHK 酶活力最高，顯著高于其他組織；管足次之；腸和性腺中總SiHK酶活力最低。

圖5 中間球海膽不同組織SiHK基因表達量和總SiHK酶活力Fig.5 Relative expression of SiHK and total SiHK activities in different tissues of Strongylocentrotus intermedius

2.2.2 高溫-酸化對中間球海膽腸組織和性腺組織中SiHK基因表達和酶活力的影響 經過60 d高溫-酸化脅迫后，中間球海膽性腺與腸組織中SiHK基因在不同處理下的相對表達量和SiHK 酶活力變化如表3和圖6所示。

表3 高溫和酸化對SiHK基因表達和總SiHK酶活力影響的雙因素方差分析Table 3 Two-way ANOVA of effects of high temperature-acidification stress on relative expression and total enzyme activities of SiHK

在腸組織中，海水升溫條件下，SiHK基因的相對表達量和總SiHK酶活力較對照顯著上升；在海水酸化條件下，SiHK基因的相對表達量較對照顯著升高，總SiHK 酶活力于對照差異不顯著；在受到高溫和海水酸化雙因素脅迫后，中間球海膽腸組織中SiHK基因的相對表達量較對照極顯著上升，總SiHK酶活力與對照組無顯著差異。

在性腺組織中，在海水升溫的條件下，SiHK基因的相對表達量與對照差異不顯著，總SiHK酶活力較對照顯著下降，其中，總SiHK 酶活力呈現(xiàn)顯著下降趨勢；在海水酸化條件下，與自然海水組相比，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達量和總SiHK酶活力與對照差異不顯著；當受到高溫和酸化雙因素脅迫后，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達量和總SiHK 酶活力與對照組相比呈現(xiàn)極顯著下降趨勢。

3 討論

3.1 中間球海膽SiHK基因的序列特征

本研究利用RACE 技術獲得了中間球海膽SiHK基因的全長cDNA 序列，對序列進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，該序列的核苷酸序列與紫球海膽SiHK的核苷酸序列相似度較高，達到91.13%，可能是在物種進化過程中，其編碼序列在種屬特異性進化中發(fā)生了不同的堿基替換等，與前人研究結果一致[19-20]。蛋白質二級結構顯示，相對于仿刺參HK 的二級結構，中間球海膽和紫球海膽的HK在二級結構上更為相似，由此表明，棘皮動物中的HK 在蛋白結構上存在一定的種屬特異性。對蛋白質的三維結構進行預測，結果表明，中間球海膽的SiHK 與人HK 在三維結構上的相似度為43.34%，由此表明，HK 在漫長的進化過程具有較強的保守性。此外，系統(tǒng)進化分析顯示，中間球海膽SiHK 與紫球海膽的HK 具有較近的親緣關系，與仿刺參HK 也具有較高的同源性，表明雖然棘皮動物HK 在蛋白質空間結構上存在一定的種屬特異性，但整體而言又具有一定的保守性。

3.2 高溫-酸化脅迫下中間球海膽腸和性腺組織SiHK基因和SiHK酶的響應模式

不同種類棘皮動物對海水酸化的響應存在種屬差異。研究表明，長期生活于酸化海水（pH 7.03）中的馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）生長速度緩慢，發(fā)育遲緩，其殼徑、腸重、口器重及體質量均受到顯著影響[21]；Stumpp等[22]發(fā)現(xiàn)在酸化海水（pH 7.70±0.02）中培育的紫球海膽，雖然其早期發(fā)育階段的代謝率增強，但是其個體發(fā)育卻比較緩慢；仿刺參可通過改變能量代謝、降低鈣化率以適應海水酸化脅迫[23]；海蛇尾（Amphiura filiformis）通過提高肌肉分解速度以適應海水酸化脅迫[24]。

糖酵解是生物體各組織細胞中普遍存在的代謝反應過程[25]，己糖激酶（HK）是糖酵解過程中的第1個限速酶。本研究對中間球海膽SiHK基因的表達量及總SiHK 酶活力進行分析，結果表明，SiHK基因表達量及總SiHK 酶活力在中間球海膽管足、圍口膜、齒間肌、體腔液、腸和性腺組織中均有表達，但存在明顯的組織特異性，與己糖激酶在大鼠不同組織的表達具有相似性[26]。值得注意的是，在同一組織中，SiHK基因的相對表達量與總SiHK 酶活力呈相反趨勢，如SiHK基因在腸和性腺組織中的相對高表達量較高，而總SiHK酶活力較低，可能是由于在腸和性腺組織中SiHK主要以尚未激活的酶原形式存在。體腔液是海膽的防御中樞和體液循環(huán)中樞，肩負抵御病原微生物、環(huán)境刺激及維持滲透壓平衡等重任，對于能量的需求較大，而己糖激酶催化的糖酵解活動是機體內糖類產能的共同途徑，因此，體腔液中較高的SiHK酶活力在一定程度上反映了中間球海膽體腔液中糖類分解代謝活動活躍。

海水升溫和海洋酸化會影響和改變海洋生物的能量代謝水平和分配方式[20,27]。本研究發(fā)現(xiàn)，高溫-酸化脅迫60 d后，在中間球海膽的腸和性腺組織中，SiHK基因的相對表達量和總SiHK 酶活力也較對照組發(fā)生了變化，且這種改變具有一定的組織特異性。

當海水溫度上升3 ℃時，中間球海膽腸組織中SiHK基因的相對表達量和總SiHK 酶活力顯著升高。研究顯示，當外界溫度在一定的溫度范圍內升高時，機體內的酶活力會隨著溫度的升高而增強，進而提高機體的代謝水平以應對不良環(huán)境[28]。中間球海膽的適宜生長溫度為18～22 ℃，水溫超過23 ℃可造成中間球海膽大量死亡[29]。由此推測，當海水升溫時，中間球海膽可能通過上調腸組織中SiHK基因的表達量來提高己糖激酶活力，從而提高糖酵解的效率，轉化吸收更多的能量來維持機體內穩(wěn)態(tài)，與沙蔥螢葉甲（Galeruca daurica）成蟲HK基因上調表達響應高溫脅迫一致[30]。當海水pH 較自然海水降低0.5 時，中間球海膽腸組織中SiHK基因的相對表達量和總SiHK酶活力也呈顯著上升趨勢，推測中間球海膽可能通過加快腸組織中糖代謝來獲得大量能量以適應海水酸化脅迫。研究表明，海水酸化脅迫可引起中間球海膽丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）活力顯著提高。己糖激酶和丙酮酸激酶均為糖酵解代謝的關鍵酶，由此表明，海水酸化對海膽的糖代謝和產能過程產生一定的影響。當受到高溫和酸化雙因素脅迫后，中間球海膽腸組織中SiHK基因的相對表達量極顯著高于對照組。與溫度相比，海水pH 可能是影響中間球海膽腸組織中糖代謝關鍵酶表達的主要因素，且海水升溫可在一定程度上緩解海水酸化對海膽代謝酶造成的影響。童歡等[31]的研究顯示，在酸化條件下，40 ℃水體中微生物的活力高于35 ℃，表明溫度的升高有利于減緩酸化對微生物的影響，與本研究結果相一致。在高溫-酸化脅迫下，中間球海膽腸組織中總SiHK酶活力較對照組差異不顯著，表明高溫和酸化對中間球海膽腸組織中總SiHK 酶活力具有協(xié)同抑制作用，與常亞青等[29]和Zhan 等[32]的研究結果相似。綜上所述，高溫-酸化脅迫會抑制中間球海膽的糖代謝活動。

當海水溫度升高3 ℃時，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達量較對照組略有下降，但差異不顯著，而總SiHK 酶活力顯著降低，說明高溫對中間球海膽性腺中糖酵解途徑的影響可能不是依靠下調SiHK基因的相對表達量，而是通過降低總SiHK酶活力。值得注意的是，這一結果與腸組織中SiHK基因的表達量和總SiHK 酶活力的檢測結果不同，由此表明，即使在同一種生物體內，不同器官對外界脅迫的響應策略也會有所不同。當海水pH 較自然海水降低0.5 時，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達量顯著降低，但總SiHK 酶活力較對照組差異不顯著。且高溫和酸化雙因素脅迫下，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達量和總SiHK 酶活力變化趨勢與單因素脅迫時略有不同，由此表明，即使是同種生物的同一器官，對不同脅迫因素的響應策略也不盡相同。當受到高溫-酸化脅迫后，中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達量較對照極顯著降低，且SiHK酶活力較對照組也極顯著降低，表明升溫和酸化對中間球海膽性腺組織中SiHK基因的相對表達量和總SiHK 酶活力具有協(xié)同抑制作用，顯著降低了中間球海膽性腺中糖酵解代謝的速率。研究顯示，海水高溫和海水酸化可引起馬糞海膽和梅氏長海膽（Echinometra mathaei）性腺發(fā)育緩慢[20,33]，本研究證實高溫-酸化雙重脅迫顯著抑制了中間球海膽性腺中糖酵解代謝中第1個限速酶的相對表達和酶活力。綜上所述，未來在高溫-酸化雙重壓力下，寒溫帶海膽的發(fā)育可能更為遲緩，生存和繁殖可能會面臨更大的挑戰(zhàn)。