馮軍軍, 姜海云, 王 靜, 景正義, 張 帆, 譚天宇, 賀 鋒,江利華, 李海芹, 常世敏, 李騰飛*

(1. 河北工程大學生命科學與食品工程學院, 河北 邯鄲 056038; 2. 邯鄲市食品藥品檢驗中心,河北 邯鄲 056004; 3. 河北工程大學材料科學與工程學院, 河北 邯鄲 056038)

豆芽又叫“芽苗菜”或“活體蔬菜”,具有較高的營養(yǎng)價值,富含多種維生素、礦物質(zhì)、游離氨基酸等對人體健康有益的成分[1-3]。近年來“毒豆芽”事件頻發(fā),豆芽中檢出植物生長調(diào)節(jié)劑、殺菌劑以及抗生素的事件時有報道[4,5],嚴重威脅消費者健康。植物生長調(diào)節(jié)劑可促進植物芽的形成,抑制植物根的生長。殺菌劑、殺蟲劑可殺滅豆芽中的細菌、霉菌及害蟲?？股仡愃幬锟煞乐垢扛癄€,從而起到保鮮的作用。長期或大量食用這類“毒豆芽”會引起肝損害、過敏反應或誘導病原體產(chǎn)生耐藥性。

目前,豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑和抗生素檢測方法均有相關標準,國家食品監(jiān)督管理局最新發(fā)布的BJS 201703《豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定》可測定豆芽中11種植物生長調(diào)節(jié)劑[6];國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布的BJS 201909《豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測定》可測定豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中的11種喹諾酮類化合物[7]; 《豆芽中氟喹諾酮類和硝基咪唑類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》(T/ZACA 021-2020)可同時測定12種抗生素[8]。而能夠同時測定豆芽中多種不同類別的植物生長調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、殺蟲劑以及抗生素的研究還未見報道。當前的檢測方法大多目標化合物類別單一,且前處理繁瑣、耗時,不能滿足快速、高效、準確,以及多目標物等處置食品安全突發(fā)事件的要求,因此選擇快速、高效的前處理方法并建立同時測定多種藥物殘留的分析方法對保障豆芽質(zhì)量安全具有重要意義。

QuEChERS法具有快速、簡單、廉價、高效、安全等特點,廣泛應用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的前處理過程中。本研究依據(jù)相關文獻[9-28]及豆芽質(zhì)量安全監(jiān)管需求,選擇了植物生長調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、殺蟲劑以及抗生素4種藥物作為目標化合物,應用改進的QuEChERS法,結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術,建立了同時測定豆芽中40種藥物殘留的方法,并對21批豆芽中的藥物殘留進行了分析。該方法拓展了現(xiàn)有檢測方法中涵蓋目標物的種類,縮短了檢測時間,為加強豆芽的質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LCMS-8030液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀、AUW120D電子天平、LabSolutions工作站(日本Shimadzu公司); KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); Direct-Q超純水儀(美國Millipore公司); HeraeusTMMegafugeTM8R冷凍離心機(美國Thermo公司); Vortex-Genie 2渦旋振蕩器(美國Scientific Industries公司); N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation公司)。

甲醇、乙腈、乙酸(色譜純)購自美國Thermo公司;甲酸為色譜純,購自北京百靈威科技有限公司;C18(50 μm)購自天津博納艾杰爾科技有限公司;氯化鈉(分析純)購自天津市瑞金特化學品有限公司;無水硫酸鎂(分析純)購自天津歐博凱化工有限公司;實驗用水為超純水;實際樣品購自本地超市和市場。

11種植物生長調(diào)節(jié)劑混合標準溶液(赤霉素、4-氟苯氧乙酸、吲哚乙酸、異戊烯腺嘌呤、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸、噻苯隆、吲哚丁酸、氯吡脲、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、多效唑)、7種喹諾酮類藥物混合標準溶液(氧氟沙星、培氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、洛美沙星、沙拉沙星)、依諾沙星、司帕沙星、矮壯素、莠去津、氟硅唑等標準溶液(純度均>98.5%)購自美國A Chemtek公司;洛硝噠唑、甲硝唑、吡蚜酮、二甲硝咪唑、滅多威、多菌靈、毒死蜱、吡唑醚菌酯、氯霉素標準溶液(純度均>98%)購自邁迪嘉(天津)科技有限公司;啶蟲脒、噻菌靈、吡蟲啉、精甲霜靈、甲霜靈、嘧菌酯、三唑磷、氯唑磷等標準溶液(純度均>99%)購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所。

1.2 標準溶液的制備

混合標準儲備液:分別移取40種標準溶液適量,以甲醇為溶劑配成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標準儲備液,于-18 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

混合標準中間溶液:分別吸取10 mg/L的混合標準儲備液1 mL于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標準溶液,密封儲存于-18 ℃冰箱。

基質(zhì)匹配混合標準溶液:分別向1 mL容量瓶中加入2、5、10、20、50、100、200 μL 1 mg/L的混合標準儲備液,用空白樣品提取液定容至刻度,配制成2、5、10、20、50、100、200 μg/L的基質(zhì)匹配混合標準溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理

準確稱取粉碎均勻的豆芽樣品5.00 g于50 mL聚丙烯離心管中,加入1顆陶瓷均質(zhì)子、4 g無水硫酸鎂和1 g NaCl后立即渦旋混合1 min,加入10 mL 1%(v/v,下同)乙酸乙腈溶液,渦旋混合1 min,超聲提取15 min, 8 000 r/min冷凍離心5 min,將上清液傾入50 mL具塞離心管中,殘渣再用10 mL 1%乙酸乙腈溶液重復提取1次,合并上清液。移取10 mL上清液在40 ℃氮吹至近干,加入1 mL 5%甲醇水溶液溶解殘渣,渦旋均勻后加入稱有100 mg C18的10 mL塑料離心管中,渦旋混合2 min, 5 000 r/min離心5 min,過0.22 μm有機濾膜后上機測試。

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;二元流動相:A為0.01%甲酸水溶液,B為甲醇。梯度洗脫程序:0～3 min, 5%B; 3～7 min, 5%B～30%B; 7～9 min, 30%B～85%B; 9～13 min, 85%B; 13～13.01 min, 85%B～5%B; 13.01～15 min, 5%B。進樣體積:10 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)源,正離子模式和負離子模式掃描;接口電壓:4.5 kV;脫溶劑氣溫度:250 ℃;加熱塊溫度:450 ℃;干燥氣流速:15 L/min;霧化氣流速:3 L/min;多反應監(jiān)測(MRM)模式。40種化合物的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在多反應監(jiān)測、正、負離子模式下,分別對脫溶劑溫度、碰撞能量、噴針位置和選擇離子等進行了充分優(yōu)化,選取經(jīng)碰撞后所得豐度較高的兩個子離子作為定量和定性離子,并確定最佳碰撞能量。最終所選擇確定的40種化合物的電離方式、母離子、子離子、碰撞能量及保留時間等參數(shù)見表1。

表 1 MRM模式下40種化合物的保留時間與質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and MS/MS parameters for the 40 compounds in MRM mode

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實驗選用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分離40種目標化合物。實驗結(jié)果表明:采用此色譜柱時，40種化合物均可得到有效分離，且色譜峰峰形較好。

在流動相的選擇實驗中,首先考察甲醇和乙腈。經(jīng)過比較,當采用乙腈為流動相時,大多數(shù)化合物分離效果優(yōu)于甲醇,靈敏度更高,但甲硝唑、喹諾酮類等部分化合物出峰時間過早,且出現(xiàn)雙峰;而采用甲醇為流動相時,各物質(zhì)均可獲得較好的分離度及較高的響應值,故選擇甲醇為強洗脫有機相。

實驗比較了水、0.01%甲酸水溶液、0.02%甲酸水溶液、0.03%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、2 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.02%甲酸)等6種水相對40種化合物靈敏度及分離度的影響。實驗發(fā)現(xiàn):當使用純水為水相時,赤霉素峰形分裂,喹諾酮類化合物響應較低,且大部分出現(xiàn)分叉、拖尾現(xiàn)象;加入0.01%甲酸后,吡蚜酮及喹諾酮類化合物峰形尖銳,靈敏度提高,但降低了赤霉素、氯霉素、2,4-D等部分化合物的峰響應值。這是由于加入甲酸可以提高吡蚜酮等化合物的離子化效率,促進了[M+H]+峰的形成,提高了質(zhì)譜響應且改善了峰形。但加入甲酸降低了赤霉素、氯霉素、2,4-D等化合物的離子化效率,抑制了[M-H]-峰的形成,降低了其在質(zhì)譜上的響應值。進一步增大甲酸濃度,毒死蜱、矮壯素等化合物色譜峰響應值變化不大,但大大降低了氯霉素、6-芐基腺嘌呤等化合物色譜峰的響應值。當使用2 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.02%甲酸)為水相時,雖可提高氯霉素、6-芐基腺嘌呤等部分化合物響應值,但會使得喹諾酮類化合物峰形變差;故經(jīng)反復試驗后選擇0.01%甲酸水溶液為水相。

在該流動相體系下,40種化合物可達到較好分離。40種化合物的標準溶液(50 μg/L)總離子流(TIC)色譜圖見圖1。

圖 1 40種化合物標準溶液的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of the 40 compoundsPeaks. 1-40 were as the same as those in Table 1.

2.3 提取條件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

為了更好地提取豆芽中40種化合物,通過添加回收的方式分別比較了甲醇、乙腈、1%氨水乙腈、1%乙酸乙腈作為提取溶劑時的提取效果,添加水平為20 μg/kg。

實驗結(jié)果表明:采用甲醇、乙腈、1%氨水乙腈時的回收率明顯低于乙腈,采用1%乙酸乙腈時的回收率最高,均高于78%。這是由于乙腈極性范圍寬、組織穿透能力強,對大多數(shù)目標化合物有較好的溶解性和提取效率,且對豆芽基質(zhì)中的脂肪、色素等有一定的去除能力,并減少基質(zhì)對目標化合物的干擾。加入乙酸不僅可以破壞豆芽基質(zhì)的組織細胞,而且可以抑制赤霉素、吲哚乙酸、2,4-D等目標化合物中羧基的解離,從而提高提取效率。因此最終選用1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.3.2提取方式的選擇

本實驗比較了超聲、振蕩兩種提取方式,通過回收率來驗證40種化合物的提取效果。添加水平為20 μg/kg,每種提取方式做3個平行。實驗結(jié)果表明:在最優(yōu)條件下,采取超聲提取的方式優(yōu)于振蕩提取,40種化合物的平均回收率為79%～111%。這可能是因為豆芽在生長過程中添加的藥物會通過代謝活動進入到組織細胞中,且還可能會以其他化合物形態(tài)存在,目標化合物與組織細胞結(jié)合較為緊密,單純的振蕩形式無法有效提取目標化合物。因此,本實驗選用超聲作為提取方式。

2.4 凈化劑用量的優(yōu)化

QuEChERS凈化法常用的吸附凈化劑有PSA、C18、石墨化炭黑(GCB),其中PSA可以吸附基質(zhì)中的糖類、色素以及脂肪酸[29]。C18可以吸附脂肪和一些礦物質(zhì)。GCB能去除部分色素、固醇和具有平面結(jié)構(gòu)等極性大的基質(zhì)的干擾[30],但對儀器檢測器識別起干擾作用,且對含有平面芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥分子有較強的吸附作用,如多菌靈[31],考慮到豆芽中色素的干擾不明顯,故不使用GCB作為凈化吸附劑。在實驗過程中,發(fā)現(xiàn)加入PSA使得極性較強的矮狀素以及吲哚乙酸、吲哚丁酸、赤霉素等含羧基化合物的回收率降低,其原因可能是由于PSA為堿性,對極性較強的矮狀素以及含有羧酸類的吲哚乙酸、吲哚丁酸等化合物有吸附作用。因此本實驗比較了不同用量的C18吸附劑對目標化合物回收率的影響,見圖2。結(jié)果表明:C18添加量在20～120 mg范圍內(nèi),各化合物的回收率差別不大。因此綜合考慮回收率及除雜效果,本實驗選擇100 mg C18作為凈化吸附劑。

圖 2 不同用量的C18對目標化合物回收率的影響Fig. 2 Effects of different dosages of C18 on the recoveries of the target compounds

2.5 基質(zhì)效應評價

為了消除樣品基質(zhì)對目標化合物測定結(jié)果的影響,本實驗采用提取后添加法[32],將陰性黃豆芽和綠豆芽按1.3節(jié)前處理方法處理后,配制50 μg/L的基質(zhì)混合標準溶液,同時采用純?nèi)軇┡渲葡嗤瑵舛鹊幕旌蠘藴嗜芤?按式(1)通過計算兩者對應的目標化合物響應值的比值作為基質(zhì)效應評估值。

(1)

式中,ME表示基質(zhì)效應大小。當ME<1.0,則基質(zhì)對待測物的響應產(chǎn)生抑制作用;當ME>1.0,則基質(zhì)對待測物的響應產(chǎn)生增強作用;當ME=1.0,則說明基質(zhì)對待測物沒有影響,這是一種理想狀態(tài)。A1為純?nèi)軇┲谢衔锏捻憫?A2為空白基質(zhì)溶液中該化合物的響應值。

結(jié)果顯示:黃豆芽中40種化合物基質(zhì)效應為0.74～2.21,綠豆芽中40種化合物基質(zhì)效應為0.61～2.15,均存在一定的抑制或增強效應。故為降低基質(zhì)效應的影響,本實驗采用空白基質(zhì)提取液配制混合標準溶液進行校正,經(jīng)校正后可有效消除基質(zhì)效應帶來的影響,提高檢測結(jié)果的準確性。

2.6 方法學驗證

2.6.1線性范圍、檢出限和定量限

按儀器工作條件對40種目標化合物的基質(zhì)匹配混合標準溶液進行測定,以40種目標化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標,以對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線,并求出相應的線性回歸方程及相關系數(shù)(r2)。在空白樣品中添加一定濃度的40種目標化合物的混合標準溶液,按1.3節(jié)進行前處理后上機測定。以3倍信噪比確定方法的檢出限(LOD),以10倍信噪比確定方法的定量限(LOQ)。40種目標化合物的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限見表2。結(jié)果表明:40種目標化合物在2～200 μg/L的范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關系,r2均達0.99以上,檢出限為0.1～3.0 μg/kg,定量限為0.3～9.0 μg/kg。

表 2 40種化合物的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, linear ranges, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the 40 compounds

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2.6.2回收率及精密度

在空白樣品中分別添加5、10、50 μg/kg 3個水平的40種混合標準溶液進行加標回收試驗,每個水平平行測定6次,見表3。

表 3 40種化合物的回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the 40 compounds (n=6)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

結(jié)果表明:40種目標化合物回收率為78.5%～115.3%,相對標準偏差(RSD)為1.3%～9.7%。測定結(jié)果均符合GB/T 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》規(guī)定,說明本方法對豆芽中40種化合物的測定均有良好的準確度和精密度。

2.7 實際樣品的測定

為了驗證本方法的可靠性,同時了解邯鄲本地豆芽中藥物殘留的情況,采用本方法對本地超市和市場采集的21批次豆芽樣品進行測定,結(jié)果見表4。其中10批次有不同程度的檢出(>LOD),其余未檢出。4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤、多菌靈、2,4-D、赤霉素和恩諾沙星檢出率較高,分別為28.6%、19.0%、9.5%、9.5%、4.8%和4.8%,含量為37.5～352.4、32.4～273.1、28.8～38.7、16.1～20.2、19.9和13.6 μg/kg。從結(jié)果可以看出,豆芽中這些藥物殘留的風險較高。

同時,將實際樣品中檢出的4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤、2,4-D、赤霉素與豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的測定方法(BJS 201703)進行比較,恩諾沙星與豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測定方法(BJS 201909)進行比較(見表4)。結(jié)果表明,本方法與標準方法測得結(jié)果基本一致,相對標準偏差為1.5%～8.3%,表明本方法數(shù)據(jù)準確可靠。

表 4 實際樣品檢測結(jié)果Table 4 Test results of real samples

2.8 與文獻方法比較

對于恩諾沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、多菌靈、莠去津、4-氯苯氧乙酸、6-芐基腺嘌呤以及赤霉素等大部分化合物的檢出限,與文獻[9,10,12,13,20-22,27,33-37]報道的方法相比(見表5),在回收率相當?shù)那闆r下,本方法的檢出限低,無需過凈化柱,樣品前處理步驟簡單、快速、靈敏、高效,且一次可以完成40種化合物的測定,擴展了豆芽中藥物檢測種類,有效提高了日常監(jiān)測效率。

表 5 本方法與文獻方法的比較Table 5 Comparison of the proposed method with references

3 結(jié)論

本文建立了QuEChERS結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測豆芽中40種藥物殘留的分析方法。該方法前處理簡單、快速、靈敏,定量結(jié)果準確,適用于豆芽中多種藥物殘留的快速檢測。與現(xiàn)行國家標準及已有文獻相比,該方法能實現(xiàn)豆芽中不同類別的植物生長調(diào)節(jié)劑、殺菌劑、殺蟲劑以及抗生素等殘留的同時檢測,大大縮短了檢測周期,不僅能夠為我國食品安全風險監(jiān)測和大量樣品篩查提供技術支撐,而且可以為以后相關國家標準的制定提供重要參考。