熊陳思慧, 定天明, 劉 杰, 易 鷗, 丁曉萍*, 謝 云

(1. 湖北中醫(yī)藥大學藥學院, 湖北 武漢 430065; 2. 湖北省藥品監(jiān)督檢驗研究院,湖北 武漢 430075; 3. 武漢美之修行信息科技有限公司, 湖北 武漢 437000)

近年來,含有美白祛斑、抗衰單體成分和植物原料的化妝品受到了廣大消費者的青睞,尤其是植物活性成分,因符合消費者天然的護膚理念,越來越多的商家將產(chǎn)品研發(fā)重心傾向于植物護膚和單體活性成分聯(lián)合使用[1]。植物成分在皮膚美白、保濕、抗衰老、防曬、抗炎以及化妝品的防腐抑菌等方面發(fā)揮著重要作用,例如苦參、紅景天、人參、積雪草、茶葉等提取物,具有美白祛斑、抗炎、抑菌、抗皺等作用[2]。此外,還有一些單體功效成分,在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的保濕、美白祛斑、抗氧化作用,例如煙酰胺、抗壞血酸葡糖苷、咖啡因、泛醇[3]。化妝品因配方不同而植物提取物添加量各異,如何檢測化妝品中植物提取物的添加量,進而與產(chǎn)品的相應功效關聯(lián),目前尚無相關標準方法。此外,因微量添加無法檢測而存在的產(chǎn)品標簽虛假標示因缺乏技術支撐而難以判定。

目前,化妝品中單體功效成分和植物活性成分的檢測方法已有報道[4-6]。HPLC方法已被用于單體功效成分煙酰胺、抗壞血酸葡糖苷、咖啡因等的檢測[7,8]。LC-MS/MS方法被用于檢測茶葉、甘草提取物等樣品中的功效成分[9,10]。然而,LC-MS/MS適用于已知目標物的分析,在沒有標準品和短時間內(nèi)難以建立檢測方法的情況下,很難快速完成檢測。而兼具離子阱和高分辨質(zhì)譜平行檢測能力的線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(LTQ/Orbitrap MS),可以通過目標成分的一級精確質(zhì)量數(shù)和二級碎片離子定性,無需對照品即可完成快速篩查和確證。

鑒于此,本研究運用超高效液相色譜(UHPLC)-LTQ/Orbitrap MS方法,采用全掃模式,建立了水、乳、霜基質(zhì)類化妝品中22種功效成分的檢測方法,為化妝品中功效成分的檢測提供技術支持,更好地服務于化妝品監(jiān)管工作。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Thermo U3000液相色譜儀,Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL組合式高分辨質(zhì)譜儀,Thermo ST16臺式離心機均購自美國Thermo Fisher公司;Vortex-Genic2旋渦混合器(美國Scientific Industries公司); Hyper Sonic DT-A超聲波清洗儀(鼎泰恒勝公司); 45位N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司); Milli-Q A10超純水機(美國Millipore公司); Mettler Toledo電子天平(梅特勒-托利多(上海)公司)。

1.2 主要材料與試劑

甲醇、乙腈(色譜純,Merck公司);甲酸(色譜純,阿拉丁公司)。

對照品:表沒食子兒茶素(批號PF200906-11,純度98.8%, CAS No. 970-74-1),甘草酸(批號Q5640050,純度99.8%, CAS No. 1405-86-3),毛蕊花糖苷(批號F2190020,純度98.4%, CAS No. 61276-17-3)購于上海安譜實驗科技股份有限公司;表兒茶素沒食子酸酯(批號PF201115-07,純度98.74%, CAS No. 1257-08-5),咖啡因(批號SM201023-13,純度100%, CAS No. 58-08-2),泛醇(批號SM190124-02,純度98.30%, CAS No. 81-13-0),抗壞血酸葡糖苷(批號YT201008-15,純度99.08%, CAS No. 129499-78-1),虎杖苷(批號PS210713-05,純度99.87%, CAS No. 27208-80-6),黃芪甲苷(批號PF200906-11,純度99.06%, CAS No. 84687-43-4)購于美國Stanford Chemicals公司;苦參堿(批號110805-202010,純度98.7%, CAS No. 519-02-8),氧化苦參堿(批號110780-201909,純度92.9%, CAS No. 16837-52-8),煙酰胺(批號100115-202005,純度99.9%, CAS No. 98-92-0),短葶山麥冬皂苷C(批號111908-201102, CAS No. 130551-41-6),山麥冬皂苷B(批號111907-201804, CAS No. 87425-34-1),甘草次酸(批號110723-201715,純度99.6%, CAS No. 471-53-4),甘草苷(批號111610-201908,純度95.0%, CAS No. 551-15-5),大黃素(批號110756-201913,純度96.0%, CAS No. 518-82-1),積雪草苷(批號110892-202006,純度93.8%, CAS No. 16830-15-2),羥基積雪草苷(批號110893-202105, 純度為93.7%, CAS No. 34540-22-2),人參皂苷Rb1(批號110704-202129,純度94.3%, CAS No. 41753-43-9),人參皂苷Re(批號110754-202129,純度96.0%, CAS No. 52286-59-6)購于中國食品藥品檢定研究院;麥冬皂苷D(批號G21O11L128330,純度98.0%, CAS No. 41753-53-3)購于源葉生物科技有限公司。

1.3 標準溶液的配制

精密稱取各對照品約5 mg用于配制標準溶液?？箟难崞咸擒罩糜?0 mL容量瓶中,用純水溶解,再用甲醇定容;甘草酸置于另一10 mL容量瓶,用甲醇溶解后定容;兩種標準溶液需臨用新配。另將大黃素和泛醇置于同一10 mL容量瓶中,用甲醇溶解后定容;其他對照品置于同一10 mL容量瓶中,用甲醇溶解后定容;所有儲備液保存于-20 ℃ 的冰箱中。

精密量取適量4種標準儲備液,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,得到質(zhì)量濃度約為100 g/L的混合標準溶液,臨用時,再用甲醇逐級稀釋成所需質(zhì)量濃度的混合標準溶液。

1.4 樣品溶液的制備

準確稱取樣品約0.2 g置于5 mL容量瓶中,加入甲醇定容至5 mL,渦旋1 min,超聲提取15 min,離心,取出上清液,部分樣品需要在40 ℃氮吹后復溶到1 mL,再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾到進樣小瓶中,待測。

部分樣品中待測物質(zhì)含量因超出線性范圍,采用甲醇稀釋后進行測定。

1.5 儀器分析

1.5.1液相色譜條件

色譜柱:Xtimate UHPLC C18 (100 mm×2. 1 mm, 1. 8 μm,美國Welch公司);流動相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脫程序:0～5 min, 5%B～8%B; 5～25 min, 8%B～60%B; 25～35 min, 60%B～80%B; 35～36 min, 80%B～5%B; 36～45 min, 5%B;流速:0. 3 mL/min;進樣量:5 μL;柱溫:30 ℃。

1.5.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)正離子模式;鞘氣(N2)和輔助氣(Ar)流速分別為40和10 arb (arbitrary unit);毛細管溫度300 ℃;離子源電壓2. 5 kV,電流100 μA;一級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 300,分辨率為60 000;多級質(zhì)譜采用高能碰撞誘導解離(HCD)模式,依賴一級質(zhì)譜掃描中的第1到第4強峰,分辨率15 000; HCD裂解能量為歸一化能量35%。22種功效成分的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表 1 22種功效成分的UHPLC-LTQ/Orbitrap MS分析參數(shù)Table 1 Analytical parameters of the 22 functional components using ultra-high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high resolution mass spectrometry (UHPLC-LTQ/Orbitrap MS)

2 結果與討論

2.1 植物提取物和單體成分的選擇

采用美麗修行大數(shù)據(jù)平臺,對化妝品中使用頻次較高的植物提取物和單體功效成分進行分析和統(tǒng)計(見圖1),發(fā)現(xiàn)甘草類(光果甘草根莖葉、甘草根、脹果甘草根)、麥冬根、人參根、黃芪根、虎杖根、苦參根、地黃根、積雪草、茶葉提取物與煙酰胺、泛醇、咖啡因、抗壞血酸葡糖苷等單體成分在化妝品中使用較多,因此,本研究選擇含有上述植物提取物和單體功效成分的產(chǎn)品為研究對象。

圖 1 截至2021年12月美麗修行數(shù)據(jù)庫中單體功效成分和植物提取物在化妝品中的歷史使用次數(shù)Fig. 1 Statistical frequencies of functional monomer components and plant extracts applied in cosmetics obtained from Beauty Evolution database before December, 2021

鑒于植物提取物中成分復雜,根據(jù)文獻[11]報道和2020年版《中國藥典》中各藥材的檢測指標,積雪草提取物(Centellaasiaticaextract)的功效成分為積雪草苷和羥基積雪草苷;甘草類(光果甘草根莖葉、甘草根、脹果甘草根)提取物(licorice extract)的功效成分為甘草次酸、甘草酸、甘草苷[12];麥冬提取物(Ophiopogonjaponicusroot extract)的功效成分為麥冬皂苷D、山麥冬皂苷B,短葶山麥冬皂苷C[13];茶葉(茶)提取物(tea extract)的功效成分為咖啡因、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯[14];人參根提取物(ginseng extract)的功效成分為人參皂苷Re和人參皂苷Rb1[15];膜莢黃芪根提取物(Astragalusmembranaceusroot extract)的功效成分為黃芪甲苷[16];虎杖根提取物(Polygonumcuspidatumroot extract)的功效成分為大黃素和虎杖苷[17];苦參根提取物(Sophoraangustifollaroot extract)的功效成分為苦參堿和氧化苦參堿[18];地黃根提取物(Rehmanniaglutinosaroot extract)的功效成分為毛蕊花糖苷[19],選擇上述植物中代表性成分對產(chǎn)品中添加的植物提取物進行篩查和檢測?？紤]到化妝品中植物提取物添加量低,選擇植物提取物在外包裝標簽標示靠前的54批產(chǎn)品作為檢測樣品,其中水劑25批、乳劑19批,霜膏基質(zhì)10批。

2.2 UHPLC-LTQ/Orbitrap MS分析條件的選擇

首先考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液兩種流動相在相同梯度洗脫條件下,對物質(zhì)分離的影響。結果表明,乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相,能夠較好地分離各物質(zhì)成分,且峰形和分辨率較好。

在1.5.1節(jié)色譜條件下,優(yōu)化干燥氣溫度、流速以及離子源溫度等質(zhì)譜參數(shù)。采用全掃模式可以獲得各物質(zhì)較好的峰形。在正、負離子模式下,采用歸一化能量為30%、35%、40%和45%高能碰撞解離,獲取二級碎片離子,結果表明在正離子模式下,歸一化碰撞能量為35%時,多數(shù)化合物碎片離子豐富,便于確定目標成分。各物質(zhì)的總離子流圖及提取離子色譜圖見圖2。

圖 2 22種功效成分的總離子流圖及提取離子色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatograms of the 22 functional components Peak identifications: 1. nicotianamine; 2. ascorbyl glucoside; 3. matrine; 4. oxymatrine; 5. D-panthenol; 6. epigallocatechin; 7. caffeine; 8. acteoside; 9. epicatechin gallate, 10. polydatin; 11. liquiritin; 12. ginsenoside Re; 13. madecassoside; 14. asiaticoside; 15. ginsenoside Rb1; 16. astragaloside A; 17. glycyrrhizinic acid; 18. liriope muscari baily saponin C; 19. emodine; 20. ophiopogonin D; 21. liriopesides B; 22. glycyrrhetic acid.

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

以水、乳、霜為樣品基質(zhì),分別選用不同體積分數(shù)的甲醇(20%、50%、80%、100%)水溶液進行提取,以加標回收率為指標考察提取效果。結果表明,采用甲醇-水體系時,當甲醇體積分數(shù)降低到50%時,提取液乳化現(xiàn)象嚴重,加入飽和氯化鈉溶液且增加離心速率較難消除乳化效應,在乳、霜基質(zhì)中100%甲醇的凈化效果優(yōu)于80%甲醇。根據(jù)功效成分的溶解性及回收率的結果,100%甲醇提取22種功效成分均能得到理想的提取效果。因此,本試驗確定提取液為甲醇。

2.4 方法學評價

2.4.1線性關系和檢出限

考察了混合標準溶液中各目標化合物的線性關系,以目標化合物的含量(x, mg/kg)和準分子離子峰面積(y)繪制標準曲線。各化合物的線性方程、相關系數(shù)(R2)、線性范圍見表2。結果表明,各化合物的線性關系良好。由于高分辨質(zhì)譜的基線噪聲較低,以S/N方法計算出的檢出限可能與方法的實際檢測值存在差別,本研究采用混合標準溶液逐級稀釋至儀器能檢出的最低含量作為各化合物的檢出限(見表2),定量限根據(jù)檢出限經(jīng)實測確定。

表 2 22種成分的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (R2), linear ranges, limits of detection (LODs), and limits of quantification (LOQs) for the 22 functional components

2.4.2方法回收率和精密度

精密稱取乳劑、霜膏基質(zhì)和水劑的空白樣品0.2 g,分別添加低、中、高3個質(zhì)量濃度水平的22種成分的混合標準溶液,根據(jù)建立的檢測方法進行加標回收試驗。每個質(zhì)量濃度重復測定3次,計算回收率和相對標準偏差(RSD),水、乳、霜3種基質(zhì)的加標回收率分別為63.2%～116.3%、63.6%～125.1%、68.9%～119.4%, RSD分別為0.18%～9.9%、0.78%～10.3%、0.78%～10.9%,結果表明,在3個不同水平下加標回收率均能滿足實驗要求。通過對乳劑加標回收率的結果分析,發(fā)現(xiàn)甘草苷、黃芪甲苷、短葶山麥冬皂苷C、麥冬皂苷D的回收率超過120%,對于這4種物質(zhì)的測定采用了基質(zhì)標準曲線對基質(zhì)干擾問題進行校正,結果發(fā)現(xiàn)其加標回收率為84.6%～113.4%, RSD為1.1%～4.9%,表明在乳劑中幾種成分存在一定的基質(zhì)干擾。

選擇線性范圍內(nèi)中濃度的混合標準溶液添加到水、乳、霜空白樣品中,在相同條件下平行處理6份,以6次測定的峰面積計算方法精密度,水劑中22種成分的RSD為0.96%～6.4%,乳劑中22種成分的RSD為1.4%～6.7%,霜膏基質(zhì)中22種成分的RSD為2.0%～10.5%。

2.5 樣品測定結果

按照所建立方法測定了2.1節(jié)所述的54批樣品,均未檢出地黃根提取物、虎杖根提取物、麥冬根提取物的代表物質(zhì),另6種植物提取物和4種單體功效成分檢測結果見表3。

54批樣品檢測結果發(fā)現(xiàn),17批標示煙酰胺、4批標示咖啡因、6批標示苦參根提取物的樣品均檢出相應功效成分;11批標示泛醇的樣品有1批未檢出;7批標示抗壞血酸葡糖苷的樣品有3批未檢出;21批標示甘草類提取物(光果甘草根莖葉、甘草根、脹果甘草根)的樣品有9批未檢出相應功效成分;21批標示積雪草提取物的樣品有11批未檢出相應功效成分;13批標示茶(茶葉)提取物的樣品有8批未檢出相應功效成分;12批人參根提取物的樣品有11批未檢出相應功效成分;6批膜莢黃芪根提取物的樣品有5批未檢出相應功效成分。

綜上所述,單體功效成分基本能夠檢出,而植物提取物的功效成分存在多批次未檢出。由于目前植物提取物原料缺乏基于功效成分的檢測方法和標準,導致無法對產(chǎn)品標示植物提取物進行質(zhì)量控制,因此,建立基于功效物質(zhì)的植物提取物原料及產(chǎn)品的檢測方法及標準,為進一步規(guī)范市場行為、更好地服務化妝品監(jiān)管,具有一定的意義。

3 結論

本研究建立了化妝品中22種功效成分的超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱質(zhì)譜檢測方法,研究結果表明該方法靈敏、準確,重復性好,能夠高效篩查和檢測化妝品中22種功效成分,為化妝品中植物提取物和單體功效成分的檢測以及化妝品監(jiān)管工作提供了一種技術手段。