周智明, 李 靜, 陳張好, 伍英英, 陸土柳, 肖樹雄

(國家藥品監(jiān)督管理局化妝品風(fēng)險評估重點實驗室(廣東省藥品檢驗所), 廣東 廣州 510525)

氧化型染料主要為苯胺類及苯酚類化合物,這些化合物有著不同程度的致敏和致畸性[1],在化妝品中使用時需嚴格控制,這一直是監(jiān)管的重點[2]。氧化型染料的準確定量是分析檢測的難點,一是由于染發(fā)膏膏體黏稠、基體溶散困難,溶散不充分會影響提取率;二是氧化型染料光、熱穩(wěn)定性差,樣品處理及分析時間過長時組分可能降解,測得含量偏低;三是染料組分多、使用濃度跨度大,檢測時各組分間往往存在相互干擾且可能同時需要進行常量和痕量測定,并要求檢驗結(jié)果與配方、標簽比對;四是苯胺類堿性物質(zhì)在流動相中易離子化,色譜保留弱,固定相的鍵合方式及流動相的酸堿度對峰形和保留影響明顯。所以針對氧化型染料,開發(fā)操作簡便、定性定量準確、適用不同應(yīng)用場景和檢測需求的檢測方法具有現(xiàn)實意義。

大部分染料揮發(fā)性弱,氣相色譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法應(yīng)用受限[3,4],標準及文獻報道中氧化型染料的測定以高效液相色譜(HPLC)[5,6]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法[7,8]為主;樣品中不同染料含量差異大,同時進行常量及痕量檢測易造成離子源污染,不適于采用HPLC-MS/MS直接測定,一般采用HPLC定量檢測、HPLC-MS/MS確證的解決方案?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)(以下簡稱《規(guī)范》)[9]收錄了75種準用染料及兩種液相色譜法:“7.1對苯二胺等8種組分”涵蓋組分少,已不能滿足監(jiān)督檢驗的需求;“7.2對苯二胺等32種組分”覆蓋種類多、定量準確,但需要分3個HPLC系統(tǒng);采用的C16柱和離子對試劑耐用性欠佳;樣品測定時存在干擾;缺乏質(zhì)譜確證方法,未能滿足監(jiān)督檢驗未知物確認程序需要。嚴巍等[10]采用C18柱,分3個HPLC系統(tǒng),根據(jù)pKa值調(diào)整流動相及pH值的方式改善了峰形,但仍不能避免樣品的干擾問題。左雪等[11,12]建立了單一HPLC系統(tǒng)分別分離33種和40種染料,避免了樣品檢測中的干擾,但只覆蓋了《規(guī)范》中法定檢測的32種染料中的27種和29種常用成分,不能涵蓋目前監(jiān)督檢驗要求的所有組分。

本研究優(yōu)化了《規(guī)范》中法定檢測的32種氧化型染料的HPLC定量測定方法,并建立了HPLC-MS/MS確證方法。HPLC法將17種常用染料及3種較少用染料共20種組分作為Ⅰ組在HPLC條件1下完成分離,8種禁用染料及4種較少用染料共12種組分作為Ⅱ組在HPLC條件2下分離,其中一個HPLC條件中的相互干擾組分均在另一個HPLC條件下完全分離,避免了實際樣品檢測時組分間的干擾,并排除了32種以外的其他15種常用染料的干擾。在日常檢測時,建議可優(yōu)先選擇HPLC法進行含量測定;當出現(xiàn)相同保留時間下光譜吸收匹配存疑、檢出結(jié)果與標簽/注冊資料不符時,可采用HPLC-MS/MS法進一步定性確證;當樣品某組分含量低于HPLC法的定量濃度、存在雜質(zhì)峰干擾導(dǎo)致HPLC法無法準確定量時,可采用HPLC-MS/MS法定量確證。方法準確可靠,專屬性強,具有較好的適用性和通用性。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

SHIMADZU LC-20AT液相色譜儀(配二極管陣列檢測器); SCIEX Triple Quad 5500液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;IkaLabDancer型渦旋混合器;Millipore Milli Q Reference型超純水發(fā)生器;Elma S300H超聲波清洗器;Mettler MSDU電子天平(十萬分之一)。

p-苯二胺、p-氨基苯酚、o-苯二胺、o-氨基苯酚、2-硝基-p-苯二胺、甲苯-3,4-二胺、苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-3-硝基苯酚、2-氨基-3-羥基吡啶、p-甲基氨基苯酚硫酸鹽、2,6-二氨基吡啶、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、1-萘酚均購自美國Sigma Aldrich公司;甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、m-氨基苯酚、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、間苯二酚、4-氨基-2-羥基甲苯、2-甲基雷瑣辛、6-氨基-m-甲酚、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺鹽酸鹽、m-苯二胺、氫醌、4-硝基-o-苯二胺、4-氯雷瑣辛、2,7-萘二酚、N-苯基-p-苯二胺、1,5-萘二酚均購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司(TCI); 2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、6-羥基吲哚均購自上海麥克林生化科技有限公司(MACKLIN)。所有對照品純度均大于96%。

甲醇、乙腈均為色譜純,購自霍尼韋爾(中國)有限公司;磷酸氫二鉀、無水乙醇、亞硫酸氫鈉、磷酸均為分析純,購自廣州化學(xué)試劑廠。

磷酸鹽緩沖液:稱取三水合磷酸氫二鉀4.56 g,加水1 L溶解,混勻,制成20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液,用磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.5,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾。

樣品為市售氧化型染發(fā)產(chǎn)品,含染發(fā)膏和氧化乳,取染發(fā)膏供含量測定。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1單標準儲備溶液的配制

稱取各染料對照品0.1 g(精確到0.000 1 g),分別置于10 mL容量瓶中。由于溶解性差異,甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液溶解定容;甲苯-3,4-二胺用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液和甲醇(1∶9, v/v)溶解定容;2-硝基-p-苯二胺和4-硝基-o-苯二胺將稱樣量減至25 mg(精確到0.000 01 g),用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶9, v/v)溶解定容,配制成質(zhì)量濃度約2.5 g/L的溶液。其余27種染料以2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)溶解定容,配制成質(zhì)量濃度約為10 g/L的各染料單標準儲備溶液。

單標準儲備溶液保存于0～4 ℃冰箱中,48 h內(nèi)使用。

1.2.2混合標準溶液的配制

32種染料混合標準溶液:取32種染料的單標準儲備溶液適量于10 mL容量瓶中,用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為250 mg/L的32種染料混合標準溶液。

Ⅰ組混合標準溶液:取p-苯二胺、p-氨基苯酚、甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、m-氨基苯酚、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、間苯二酚、2-硝基-p-苯二胺、4-氨基-2-羥基甲苯、2-甲基雷瑣辛、苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-3-硝基苯酚、2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、4-氨基-m-甲酚、2-氨基-3-羥基吡啶、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、2,6-二氨基吡啶、6-羥基吲哚、4-氯雷瑣辛、1,5-萘二酚、1-萘酚的單標準儲備溶液適量于10 mL容量瓶中,用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的Ⅰ組混合標準溶液。

Ⅱ組混合標準溶液:取o-苯二胺、o-氨基苯酚、甲苯-3,4-二胺、6-氨基-m-甲酚、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺鹽酸鹽、m-苯二胺、氫醌、p-甲基氨基苯酚硫酸鹽、4-硝基-o-苯二胺、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸鹽、2,7-萘二酚、N-苯基-p-苯二胺的單標準儲備溶液適量于10 mL容量瓶中,用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)稀釋至刻度,配制成質(zhì)量濃度為500 mg/L的Ⅱ組混合標準溶液。

1.2.3混合標準系列溶液的配制

分別?、窠M和Ⅱ組混合標準溶液適量,用2 g/L亞硫酸氫鈉水溶液-甲醇(1∶1, v/v)稀釋,配制成質(zhì)量濃度為10、25、50、100、250、500 mg/L的Ⅰ組和Ⅱ組混合標準系列溶液?；旌蠘藴氏盗腥芤号R用現(xiàn)配。

1.3 樣品處理

稱取樣品0.5 g(精確至0.001 g)于25 mL具塞比色管中,加入10 g/L亞硫酸氫鈉水溶液2.0 mL,用無水乙醇-水(1∶1, v/v)混合溶液溶解并定容,渦旋振蕩30 s使試樣與提取溶劑充分混勻,冰浴超聲提取10 min,如樣品渾濁可在10 000 r/min下離心5 min。取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,濾液作為待測溶液,并盡快測定。

1.4 儀器條件

1.4.1HPLC條件

色譜柱:Shimadzu Shim-pack GIST C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:25 ℃;進樣體積:5 μL;流速:1.0 mL/min;檢測波長:280 nm。分兩個HPLC條件(條件1、條件2)分離,流動相及梯度洗脫條件見表1。

表 1 32種染料的HPLC及HPLC-MS/MS流動相梯度條件Table 1 Mobile phase gradient conditions of HPLC and HPLC-MS/MS for the 32 dyes

1.4.2HPLC-MS/MS條件

色譜柱:Waters atlant T3(150 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫:30 ℃;進樣體積:2 μL;流速:0.3 mL/min;流動相及梯度洗脫條件見表1。離子源:電噴霧離子(ESI)源;監(jiān)測模式:多反應(yīng)監(jiān)測模式;監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表2;霧化氣流速:3 L/min;干燥氣流速:15 L/min;脫溶劑管溫度:250 ℃;離子源加熱溫度:400 ℃;碰撞氣:Ar, 230 kPa。

表 2 32種染料的電離模式、母離子、子離子、碰撞能及保留時間Table 2 Ionization modes, parent ions, daughter ions, collision energies, and retention times (tR) of the 32 dyes

表 2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2 結(jié)果與討論

2.1 分組的確定

基于文獻[13-15]數(shù)據(jù)、91批注冊樣品的標識配方及1 462批監(jiān)督抽檢樣品的檢測結(jié)果,總結(jié)了染發(fā)類產(chǎn)品中32種染料的使用情況,其中常用染料17種(平均使用頻率>1%),較少用染料7種(平均使用頻率<1%),禁用染料8種。在《規(guī)范》中,17種常用染料分3個HPLC體系測定,標準溶液分3組配制避免相互干擾,但實際樣品測定時,樣品中所含有的處于不同分組的染料相互間往往存在干擾。本方法將32種染料分為兩組,分別在兩個HPLC條件下檢測:將17種常用染料及3種較少用染料分在Ⅰ組,使用HPLC條件1分離;8種禁用染料及4種較少用染料分在Ⅱ組,使用HPLC條件2分離。32種染料的使用頻率及分組見表3。

表 3 32種染料的使用頻率及分組Table 3 Application frequency and grouping of the 32 dyes

2.2 干擾研究

2.2.132種染料間的干擾情況

32種染料在兩個HPLC體系下的分離圖譜如圖1、圖2所示。在HPLC條件1下,有10個組分未完全分離,分別為2,6-二氨基吡啶和間苯二胺、o-氨基苯酚和間苯二酚、p-甲基氨基苯酚硫酸鹽和N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、甲苯-3,4-二胺和4-硝基-o-苯二胺、1,5-萘二酚和2,7-萘二酚。其中,除o-氨基苯酚和間苯二酚需要用HPLC-MS/MS確證外,其余8個組分均可在HPLC條件2中完全分離,這兩個組分中o-氨基苯酚在2015年被列為禁用染料,因此,本方法的分組條件能夠避免32種染料組分間的相互干擾。

圖 1 HPLC條件1下32種染料的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 32 dyes under HPLC condition 1For peak numbers, see Table 2.

圖 2 HPLC條件2下32種染料的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the 32 dyes under HPLC condition 2For peak numbers, see Table 2.

2.2.2其他常用染料的干擾情況

方法開發(fā)時還應(yīng)盡量避免32種以外可能使用的染料對樣品檢測的干擾。本文試驗了32種以外的其他15種常用染料對被測組分的干擾情況,保留時間(tR)及干擾結(jié)果如表4所示,2-氨基-4-羥乙氨基茴香醚和羥苯并嗎啉對苯基甲基吡唑啉酮的檢測在兩個HPLC條件下存在干擾,其余組分均無干擾或可用其中一個色譜條件排除。

表 4 其他15種常用染料的HPLC保留時間及可能干擾的32種染料的序號Table 4 HPLC retention times of 15 other common dyes and interference dye Nos. of the 32 dyes

2.3 色譜條件優(yōu)化

2.3.1色譜柱的選擇

《規(guī)范》采用酰胺類C16柱,適合分離苯胺類染料,但通用性欠佳且離子對試劑對色譜柱損傷大。本文選擇雜化、包膜或聚合物封端技術(shù)的C18柱,可屏蔽硅羥基及金屬離子影響,通過用磷酸鹽改善苯胺類峰形,嘗試了5 μm粒徑柱及2.7 μm粒徑核殼柱,兩種色譜柱均可滿足分離要求。核殼C18柱分離時間短、效率高,但出峰密集且粒徑小易堵塞,考慮大規(guī)模監(jiān)督抽檢使用及實際樣品中可能存在的雜質(zhì)干擾,故選擇5 μm粒徑C18柱。市售3種具有雜化或者封端技術(shù)的5 μm粒徑C18柱(規(guī)格為250 mm×4.6 mm, 5 μm)在HPLC條件1下Ⅰ組20種染料的分離結(jié)果如圖3所示,方法通用性及分離效果均能滿足要求。

圖 3 采用不同品牌色譜柱時HPLC條件1下Ⅰ組染料的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of dye group Ⅰ with different brands of columns under HPLC condition 1 For peak numbers, see Table 2.

2.3.2流動相的選擇

以Ⅰ組染料成分的分離效果作為流動相種類、pH值和柱溫選擇的判定標準。在有機相的選擇上,甲醇和乙腈選擇性各異,對相鄰組分的分離效果不同,單獨使用甲醇或乙腈均不能完全分離:使用甲醇時,組分出峰時間后移,分離效果差;使用乙腈時,N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽和2-甲基雷瑣辛不能完全分離,同時使用甲醇和乙腈時分離效果可滿足要求。對于磷酸鹽緩沖液,經(jīng)試驗,鉀鹽分離效果較鈉鹽、銨鹽好,尤其對間苯二酚、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽和2-甲基雷瑣辛組分的分離。兩種鉀鹽比較,使用磷酸氫二鉀時,2-氯-p-苯二胺硫酸鹽和間苯二酚峰形更佳。采用不同流動相種類時HPLC條件1下Ⅰ組20種染料的分離結(jié)果見圖4。綜上,使用三元梯度分析,選擇磷酸氫二鉀-甲醇-乙腈作為流動相。

圖 4 采用不同流動相種類時HPLC條件1下Ⅰ組染料的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of dye group Ⅰ with different types of the mobile phase under HPLC condition 1

2.3.3pH的選擇

32種染料覆蓋酸/堿性物質(zhì),降低流動相pH值有利于防止酸性物質(zhì)離子化,使其以分子形式存在于色譜柱上得到分離,而提高pH值則相反,故需確定能同時滿足兩性物質(zhì)檢測的pH條件。未使用離子對,流動相的酸度變化顯著影響出峰時間,堿性條件更有利于分離,尤其是2-硝基-p-苯二胺和苯基甲基吡唑啉酮、4-氨基-2-羥基甲苯和4-氨基-3-硝基苯酚、4-氯雷瑣辛和6-羥基吲哚的分離。經(jīng)試驗,HPLC條件1下不同流動相pH條件時Ⅰ組20種染料的分離結(jié)果見圖5。pH為7.5時能實現(xiàn)20種組分的完全分離,故選擇流動相pH為7.5。

圖 5 采用不同流動相pH時HPLC條件1下Ⅰ組染料的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of dye group Ⅰ with different pH levels of the mobile phase under HPLC condition 1

2.3.4柱溫的選擇

考察了20、25、30、40 ℃下Ⅰ組20種染料在HPLC條件1下的分離情況,溫度過高會影響色譜柱的使用壽命,且隨著溫度升高,各染料組分保留時間逐漸縮短,分離度下降,20和25 ℃分離效果較好,綜合考慮溫度控制的難易程度和組分的分離度,選擇色譜柱溫度為25 ℃。

2.4 樣品前處理條件優(yōu)化

2.4.1抗氧化劑種類及使用量的選擇

市售染發(fā)類產(chǎn)品中抗氧化劑主要有亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸和異抗壞血酸。本研究以自制不含抗氧化劑、染料及其中間體的樣品(主要成分為水、鯨蠟硬脂醇、礦油、平平加、西曲氯胺、聚二甲基硅氧烷、EDTA二鈉)作為空白樣品,稱取0.5 g于25 mL比色管中,加入500 mg/L的Ⅰ組20種染料的儲備溶液1.0 mL,以此作為加標樣品考察了上述4種抗氧化劑及亞硫酸氫鈉-抗壞血酸混合使用對Ⅰ組20種染料的抗氧化能力,結(jié)果表明,5種抗氧化溶液在48 h內(nèi)抗氧化能力相當,抗壞血酸和異抗壞血酸溶劑峰較大,亞硫酸氫鈉溶劑峰最小,因此確定為樣品前處理的抗氧化劑。

在加標樣品中分別加入10 g/L亞硫酸氫鈉溶液0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL, 48 h穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明,在不添加抗氧化劑的條件下,2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、2-氯-p-苯二胺硫酸鹽、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、2-甲基雷瑣辛4種組分在第二天檢測時降解明顯,回收率下降。亞硫酸氫鈉添加量在1.0 mL以上時結(jié)果穩(wěn)定,為了保證不同樣品基質(zhì)下抗氧化能力的穩(wěn)定性,采用亞硫酸氫鈉添加量為2.0 mL。

2.4.2提取溶劑的選擇

試驗了無水乙醇-水(1∶1, v/v)溶液、甲醇-水(1∶1, v/v)溶液、乙腈-水(1∶1, v/v)溶液3種提取溶劑對Ⅰ組染料的提取效果。3種提取溶劑均能取得理想的回收率,結(jié)果無顯著差異,考慮溶劑的安全性,采用無水乙醇-水(1∶1, v/v)溶液作為樣品處理的提取溶劑。

2.5 HPLC-MS/MS條件的選擇

HPLC采用保留時間和光譜吸收定性,具有非唯一性,在實際樣品檢測中,如出現(xiàn)相同保留時間下光譜吸收匹配存疑、雜質(zhì)峰干擾或檢出結(jié)果與標簽、注冊資料不符等情況,可按照未知物確認程序采用HPLC-MS/MS方法進行確證。

分別配制32種染料溶液(氫醌質(zhì)量濃度為10 mg/L,其他組分質(zhì)量濃度為1 mg/L),以甲醇-水(1∶1, v/v)為基準流動相,采用直接進樣方式將標準溶液注入離子源,對32種染料的MRM條件進行優(yōu)化,母離子m/z、子離子m/z、碰撞能和保留時間見表2。

分別選用5 mmol/L乙酸-乙腈、5 mmol/L乙酸銨-乙腈、5 mmol/L甲酸-乙腈、水-乙腈、0.1%氨水-乙腈等優(yōu)化流動相組成。經(jīng)實驗驗證,甲酸-乙腈條件下峰形欠佳;水-乙腈和氨水-乙腈條件下,負離子模式檢測的組分拖尾嚴重。乙酸-乙腈條件下質(zhì)譜響應(yīng)最大、峰形最好,但在正離子模式下,部分組分的色譜峰基本不保留,分離困難。乙酸銨-乙腈為流動相時,各組分的色譜保留和分離度較好,但負離子模式下響應(yīng)低,尤其是間苯二酚、2-甲基雷瑣辛、4-氨基-3-硝基苯酚和氫醌等組分。綜合質(zhì)譜響應(yīng)和質(zhì)譜保留,選用乙酸銨-乙腈為正離子模式下的流動相;乙酸-乙腈為負離子模式下的流動相。

比較了不同濃度的乙酸和乙酸銨(5、10、20 mmol/L)的效果,結(jié)果表明,提高乙酸和乙酸銨的濃度,組分的分離和響應(yīng)沒有顯著影響,過高濃度的酸和鹽損害色譜柱的使用壽命,因此,選擇乙酸和乙酸銨的濃度為5 mmol/L。

32種染料中包含的6對同分異構(gòu)體分別是p-苯二胺、o-苯二胺和m-苯二胺;p-氨基苯酚、m-氨基苯酚和o-氨基苯酚;甲苯-2,5-二胺硫酸鹽和甲苯-3,4-二胺;4-氨基-2-羥基甲苯、6-氨基-m-甲酚、4-氨基-m-甲酚和p-甲基氨基苯酚硫酸鹽;間苯二酚和氫醌;2,7-萘二酚和1,5-萘二酚。在上述HPLC條件下,各同分異構(gòu)體組分的保留時間如表2所示,6對同分異構(gòu)體均完全分離。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1標準曲線及檢出濃度

在本方法條件下考察一定濃度范圍內(nèi)HPLC和HPLC-MS/MS法測得的各被測物質(zhì)峰面積對應(yīng)濃度的線性相關(guān)性。在信噪比為3、樣品稱樣量0.5 g、稀釋25倍條件下計算本方法的檢出限。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限見表5。

表 5 HPLC和HPLC-MS/MS方法中32種染料的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 5 Linear ranges, correlation coefficients (r2), and limits of detection (LODs) of the 32 dyes determined using HPLC and HPLC-MS/MS

表 5 (續(xù))Table 5 (Continued)

結(jié)果表明,HPLC方法中32種染料在大約10～500 mg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好(r2>0.99),檢出限為9.7～40.1 μg/g; HPLC-MS/MS方法中氫醌的線性范圍為2.0～79.7 mg/L,檢出限為8.0 μg/g,其他組分的線性范圍約為0.1～4 mg/L,檢出限為0.01～0.4 μg/g。

2.6.2精密度及穩(wěn)定性

分別以10、500 mg/L和0.1、4 mg/L的混合標準溶液考察HPLC和HPLC-MS/MS法的精密度和標準溶液的穩(wěn)定性。每個濃度連續(xù)進樣6次,計算日內(nèi)精密度的RSD,3天內(nèi)每天連續(xù)進樣6次,計算日間精密度的RSD;于0、2、4、8、12、24、48、72 h進樣,計算48 h和72 h內(nèi)穩(wěn)定性的RSD。日內(nèi)、日間精密度和穩(wěn)定性結(jié)果見表6。

表 6 HPLC和HPLC-MS/MS方法中32種染料的精密度(n=6)和穩(wěn)定性Table 6 Precisions (n=6) and stabilities of the 32 dyes determined using HPLC and HPLC-MS/MS RSD/%

表 6 (續(xù))Table 6 (Continued) RSD/%

結(jié)果表明,32種染料的精密度和48 h穩(wěn)定性的RSD在HPLC方法中小于5%, HPLC-MS/MS方法中小于10%,符合兩個檢測方法的精密度和穩(wěn)定性要求。部分組分72 h的穩(wěn)定性RSD>10%,建議配制染料組分的單標儲備溶液保存,混合標準系列溶液在48 h內(nèi)使用。

2.6.3加標回收率

取空白樣品0.5 g(精確到0.001 g)于25 mL具塞比色管中,分別精密加入500 mg/L混合標準系列溶液和5 g/L混合標準儲備溶液1.0 mL,作為加標量分別為1 000 μg/g和10 000 μg/g的HPLC方法加標回收溶液;精密加入氫醌(500 mg/L)和其余組分混合標準溶液(25 mg/L)0.5 mL,作為加標量分別為25 μg/g的HPLC-MS/MS方法的加標回收溶液。平行制備6份,HPLC和HPLC-MS/MS法的回收率及RSD結(jié)果如表7所示,兩個方法的回收率范圍分別為85.1%～114.7%(RSD<5%)和82.6%～114.9%(RSD<10%)。

表 7 HPLC和HPLC-MS/MS方法中32種染料的加標回收率(n=6)Table 7 Spiked recoveries of the 32 dyes analyzed with HPLC and HPLC-MS/MS (n=6)

2.7 樣品測定

為比較3個方法對樣品檢測結(jié)果的一致性,本實驗收集10個市售氧化型染發(fā)產(chǎn)品,分別采用《規(guī)范》“7.2對苯二胺等32種組分”、本文的HPLC和HPLC-MS/MS方法進行檢測。其中1個染發(fā)產(chǎn)品的HPLC條件1下的色譜圖見圖6。10批樣品共檢出16種染料,分別為p-苯二胺、p-氨基苯酚、甲苯-2,5-二胺硫酸鹽、m-氨基苯酚、間苯二酚、4-氨基-2-羥基甲苯、2-甲基雷瑣辛、苯基甲基吡唑啉酮、2,4-二氨基苯氧基乙醇鹽酸鹽、4-氨基-m-甲酚、2-氨基-3-羥基吡啶、N,N-雙(2-羥乙基)-p-苯二胺硫酸鹽、2,6-二氨基吡啶、6-羥基吲哚、4-氯雷瑣辛、1-萘酚。檢出含量范圍為58～25 160 μg/g, 3個方法檢測結(jié)果的RSD為1.9%～10.1%。所有檢出組分均包含在本方法的Ⅰ組中。

圖 6 1個染發(fā)產(chǎn)品在HPLC條件1下的色譜圖Fig. 6 Chromatogram of a hair dye sample under HPLC condition 1For peak numbers, see Table 2.

3 結(jié)論

本文建立了32種氧化型染料的HPLC檢測方法和HPLC-MS/MS確證方法,相比《規(guī)范》標準方法,本方法使用常規(guī)C18柱替換酰胺類C16柱,不使用離子對試劑,增加了方法的通用性;基于染料使用頻率分組分離的HPLC方法能夠避免實際樣品中染料組分間的干擾,常用染料可在HPLC條件1中完成檢測,減少了注冊檢驗中染料組分檢測的工作量;與文獻[10-12]報道方法相比,本方法能夠全部覆蓋目前監(jiān)督抽檢要求的染料組分,并建立了HPLC-MS/MS確證方法,更好地滿足監(jiān)督檢驗的需求。方法簡便準確,通用性和穩(wěn)定性良好,能夠作為染發(fā)類產(chǎn)品中多種染料檢測的標準推廣方法。