張亞婷，陳靜，張娟麗，徐丁

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是一種無包膜的單正鏈RNA病毒，屬于小核糖核酸病毒科，是引起手足口病或皰疹性咽峽炎的主要病原體。自1967年在美國加利福尼亞州發(fā)現(xiàn)以來，在全球范圍內(nèi)EV71已引起數(shù)次大規(guī)模流行，重癥病例多由其引起，且病情兇險，病死率高［1-2］。國內(nèi)最嚴(yán)重的疫情發(fā)生在2010年，估計有170萬人感染，其中27 000例合并嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，最終導(dǎo)致了905人死亡［3］。據(jù)統(tǒng)計，在國內(nèi)因手足口病引起的死亡病例中，超過90%由EV71感染所致。隨著EV-71滅活疫苗的使用，過去幾年死亡率逐步下降。

目前尚無確切有效的治療手足口病的藥物［4］，臨床工作中，利巴韋林及Ⅰ型干擾素是最常用的用于治療EV71感染的藥物［5］，此外，一些化合物，如Rupintrivir［6-7］，在兩種細胞系中均表現(xiàn)出抗EV71的活性，但臨床應(yīng)用尚不成熟。因此，研究有效的抗EV71病毒藥物具有重要的臨床意義。槲皮素是植物中分布最廣的黃酮類化合物之一，目前多項研究已經(jīng)證實其能夠有效抑制多種逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，如皰疹病毒Ⅰ型、呼吸道合胞病毒［8］、丙型肝炎病毒［9］；此外，也有體外抑制乙型肝炎病毒、甲型流感病毒H1N1和人2型登革病毒感染的研究［10-12］。為此，本實驗旨在研究槲皮素體外抗腸道病毒71的能力，并對其抗病毒機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料腸道病毒71型（C4亞型）（甘肅省疾病控制中心臨床分離株）；人橫紋肌肉瘤細胞RD細 胞（Human rhabdomyosarcoma cells，RD細胞）（中科院上海細胞所），槲皮素（Sigma-Aldrich，批號：100081-201509），EV-A71 VP1抗體（臺灣Abnova公司，批號：MAB5667-M03），Toll樣受體7（Toll-Like Receptor 7，TLR-7）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH）及半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗體（均購自上海Cell Signaling Technology公司）。

1.2 主要實驗儀器PCR儀（Takara公司）；蛋白電泳儀，轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad）。

1.3 實驗方法

1.3.1 TCID50測定病毒滴度將EV71病毒用細胞維持液從1×10-1～1×10-8做10倍系列稀釋，每個稀釋度設(shè)6個重復(fù)孔，將各稀釋度的病毒液取100μL接種于細胞生長良好的單層RD細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，觀察細胞病變程度并記錄。用Reed-Muench法計算感染RD細胞中具有細胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）的孔數(shù)，計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（tissue culture infective dose 50%，TCID50），即50%的細胞發(fā)生CPE時的病毒稀釋度。

1.3.2 槲皮素藥物毒性測定將槲皮素分別用細胞維持液稀釋為100、50、25、12、6、3μM 6個濃度，然后分別加入RD細胞已長成單層的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，每一濃度設(shè)置3個復(fù)孔，同時設(shè)立正常細胞對照組，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察48 h，MTT法測定細胞活力，50%的細胞發(fā)生病變時的藥物濃度為CC50。實驗重復(fù)3次。

1.3.3 槲皮素抗病毒活性實驗將處于對數(shù)生長期的RD細胞接種于96孔培養(yǎng)板上，37℃條件下用100 TCID50 EV71在槲皮素連續(xù)稀釋液中感染細胞，直到達到適當(dāng)?shù)募毎∽冃?yīng)，在顯微鏡下觀察槲皮素對EV71誘導(dǎo)的CPE的影響，并記錄細胞形態(tài)。MTT法測定細胞活力，能夠有效抑制50%細胞感染病毒的藥物濃度為EC50，SIs按CC50∶EC50比值計算。

1.3.4 槲皮素抗病毒CPE實驗原理：被感染后細胞大多可引起細胞病變（感染細胞會出現(xiàn)變圓、壞死、破碎或者脫落），這與其他病毒的表現(xiàn)形式有所不同，無需染色便可直接在普通光學(xué)顯微鏡下觀察。因此我們通過比較相同條件下的MOI病毒感染下實驗組與對照組的細胞病變效應(yīng)差異，便可直接看出槲皮素抗EV71病毒感染的能力。操作步驟：培養(yǎng)細胞在鋪板后24 h感染相同MOI病毒，實驗組加槲皮素，24 h后在鏡下觀察并拍照。

1.3.5 Western blot法檢測EV71病毒蛋白VP1表達情況RD細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板，槲皮素預(yù)處理細胞2 h，接入病毒，培養(yǎng)24 h后，不同處理細胞樣品進行電泳并轉(zhuǎn)膜。加入一抗，4℃過夜，棄一抗，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗于37℃條件下?lián)u床孵育2 h，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)成像拍照分析。

1.3.6 RT-PCR法檢測槲皮素對IL-6、IL-8及Caspase3的作用將不同實驗組處理的六孔板細胞接入相同MOI的EV71病毒，培養(yǎng)24 h后，棄去上清，以PBS洗細胞1次，每孔加入1 mL Trizol裂解，抽提細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR運行程序為：95℃4 min，94℃45 s，58℃45 s，72℃1 min，35個循環(huán)，72℃10 min。將PCR擴增產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，UVP凝膠成像系統(tǒng)拍照。引物系列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件包，計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素體外抗病毒能力實驗

2.1.1 病毒毒力及槲皮素抑制病毒感染檢測RD細胞感染EV71病毒48 h后，鏡下觀察，病毒組細胞形態(tài)與正常對照組比較，細胞變圓、萎縮、脫落，細胞間連接斷裂甚或消失，出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)，進一步研究發(fā)現(xiàn)，相同MOI的EV71感染的RD細胞出現(xiàn)會明顯的CPE，而槲皮素處理（20μM）能夠明顯抑制病毒誘導(dǎo)的CPE，見圖1。

圖1 光學(xué)顯微鏡下各組細胞形態(tài)（x200）

2.1.2 病毒毒力及槲皮素細胞毒性試驗MTT法測定結(jié)果表明EV71對RD細胞的TCID50為10-4.5，槲皮素的細胞毒性效應(yīng)通過細胞活力測定，結(jié)果表明，槲皮素對RD細胞具有較低的細胞毒性，MTT法檢測細胞活力，見圖2。并且在濃度達到100μM時未觀察到明顯的形態(tài)學(xué)細胞毒作用，50%細胞毒性濃度（CC50）值＞100μM，同時發(fā)現(xiàn)槲皮素在10～25μM之間均能夠有效抑制RD細胞感染EV71，在沒有槲皮素的情況下，相同MOI的EV71感染的RD細胞出現(xiàn)明顯的CPE，而槲皮素處理（12μM）能夠明顯抑制病毒誘導(dǎo)的CPE。

圖2 MTT法檢測不同處理組細胞活力

2.1.3 EV71病毒蛋白表達受槲皮素抑制情況將不同實驗組［RD細胞組、RD+EV71組、RD+EV71+槲皮素組（5μM）、RD+EV71+槲皮素（10μM）及RD+EV71+槲皮素（20μM）］，相同MOI病毒感染RD細胞，在槲皮素處理實驗組中，病毒蛋白表達量明顯低于其余組，并且槲皮素對于病毒抑制具有劑量依賴性，在20μM時EV71在細胞中的復(fù)制受到明顯抑制，見圖3。

圖3 Western blot檢測病毒VP1蛋白電泳圖

2.2 槲皮素抑制EV71機制研究

2.2.1 槲皮素對TLR-7（toll樣受體7）表達的影響針對上述不同實驗組，Western blot檢測TLR-7表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EV71病毒感染可明顯誘導(dǎo)TLR7蛋白表達，但槲皮素處理組不影響TLR7表達水平，見圖4。

圖4 槲皮素處理對TLR-7表達的影響

2.2.2 槲皮素處理對IL-6、IL-8及Caspase3的作用病毒產(chǎn)量及IL-6隨著槲皮素濃度的增加而下降，提示槲皮素能夠通過抑制TL-6誘導(dǎo)的細胞毒性效應(yīng)，同時具有劑量依賴性，見圖5。EV71感染組Caspase-3表達明顯增高，而槲皮素處理組Caspase3表達水平受到抑制。

圖5 EV71感染后槲皮素對IL-6及IL-8表達的影響

3 討論

腸道病毒71型所致手足口病目前仍是世界各國，尤其是亞太地區(qū)的一個重要公共衛(wèi)生問題，目前尚無有效治療藥物［13-14］。作為黃酮類化合物的重要組成-槲皮素，目前已有大量相關(guān)文獻體外證實其具有顯著抗病毒活性。然而，更進一步針對其藥理特性及抗病毒機制的研究是非常必要的。本課題組體外實驗證實，槲皮素50%細胞毒性濃度（CC50）值＞100μM，EC50為15μM。這表明，治療劑量的槲皮素不會顯著抑制細胞生長，能有效抑制病毒感染，計算SI至少大于6，依據(jù)（SI）值≥4種被認為適用于抗病毒藥物［8］，表明槲皮素可以作為一種有效的抗EV71藥物，其在治療EV71感染方面具有潛在的應(yīng)用價值。

先天免疫系統(tǒng)對病原微生物的快速識別及清除對于自身穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，固有免疫細胞絕大多數(shù)是通過細胞表面或者不同細胞內(nèi)隔間表達的模式識別受體識別病毒的感染，這些模式識別受體包括Retinoic acid-inducible gene I（RIGI）樣受體（RLRs），Toll樣受體（TLRs），以及NOD樣受體（NLRs）。TLR-7，該 基 因也被稱為PYPAF3、NALP7、PAN7、NOD12、CLR19.4和HYDM，在人類19號染色體長臂q13.42位置，TLR7不僅在腦內(nèi)的主要免疫細胞小膠質(zhì)細胞中表達，而且神經(jīng)元中也有表達［15］。盡管TLR7和TLR8都能識別單鏈RNA（ssRNA），但多項研究證實，TLR7是大腦中識別ssRNA的主要TLR［16］。針對其功能研究發(fā)現(xiàn)，TLR7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)紊亂和炎癥反應(yīng)中起著多種作用，猴免疫缺陷病毒（SIV）感染恒河猴腦后，分泌的microRNA21激活TLR7通路，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?7］；有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，TLR7-MyD88-Caspase3軸在單鏈RNA病毒引起的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥病變中發(fā)揮重要作用［18］。動物實驗證實，TLR7-MyD88-c-Fos-IL-6信號通路能夠在腦內(nèi)負向調(diào)控樹突狀細胞的生長［16］。值得關(guān)注的是，2019年有學(xué)者通過體內(nèi)體外試驗提出，TLR7/IL-6/Caspase3凋亡軸在EV71感染發(fā)病機制中起重要作用［19］。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，高水平的細胞因子，如IL-1、IL-6、IL-10等與肺水腫和神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重程度相關(guān)［20］。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6是EV71相關(guān)性腦炎的獨立預(yù)測因子，在EV71感染的發(fā)病機制中起重要作用［21］。與此同時，另外一項針對新生小鼠模型的研究顯示，EV71感染后產(chǎn)生的持續(xù)高水平IL-6會導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷，而在臨床癥狀出現(xiàn)后給予抗IL-6中和抗體，可以極大地改善宿主的生存率和臨床評分，因此，抗IL-6可作為EV71感染的潛在治療候選者［22］。此外，目前已有大量研究證實，EV71感染后通過非結(jié)構(gòu)性蛋白3C激活caspase-3，由此誘導(dǎo)的宿主細胞凋亡在其發(fā)病機制中起重要作用［23］。2018年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，抑制caspase-3的活性可以減弱3C引起的細胞凋亡，同時降低EV71病毒蛋白的表達，提示抑制caspase-3可作為一種潛在治療手足口病的選擇靶點來考慮［24-25］。

2021年，一項系統(tǒng)評價研究認為，補充槲皮素及其衍生物可以減少促炎癥細胞因子、趨化因子、活性氧、黏液分泌等，可以作為治療病毒性下呼吸道感染的候選藥物［26］。此外，目前也有多篇文獻從機制方面探討槲皮素治療新冠肺炎的意義，例如有研究認為，槲皮素能夠抑制抑制3CLpro和PLpro的結(jié)合能分，槲皮素在理論上具有干擾SARS-CoV-2復(fù)制的能力［27］。針對EV71感染，研究認為，槲皮素能有效抑制EV71的3Cpro活性，從而阻斷EV71的復(fù)制［28］。但須明確的是，如果要將槲皮素作為抗病毒藥物使用，那更進一步地針對其藥理特性和臨床使用的研究是非常有必要的，且目前針對槲皮素體內(nèi)研究尚處于初步階段，缺乏長期體內(nèi)研究的臨床數(shù)據(jù)及相關(guān)部門的監(jiān)管，而詳細的藥代動力學(xué)，藥效學(xué)和長期毒理學(xué)研究亦是必要的。

本實驗發(fā)現(xiàn)，EV71體外感染RD細胞可上調(diào)TLR-7表達水平，而槲皮素可以顯著抑制IL-6及Caspase-3表達，體外實驗證實具有明顯的抗細胞凋亡作用，且細胞毒性較低，具有潛在的臨床應(yīng)用前景，有望用于EV71感染引起的手足口病的治療。