陳懿榕，闕任燁，劉進鍇，林柳兵，李勇△

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071；2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院；3 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院

肝纖維化是一種在持續(xù)性的肝損傷下，發(fā)生組織修復(fù)反應(yīng)的動態(tài)過程，是由于細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的合成、降解及沉積不平衡引起的病理變化，包含了復(fù)雜的細胞和分子機制［1］。防止肝硬化發(fā)生和改善肝臟疾病預(yù)后的關(guān)鍵在于阻止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化［2］。TGFβ-Smad信號傳導(dǎo)通路是肝纖維化主要的信息傳導(dǎo)途徑［3-4］。柴胡皂苷d（saikosaponins-d，SSd）是中藥柴胡的有效藥理成分，是一種植物雌激素，可以抑制肝星狀細胞的增殖，減少細胞周期的作用。本研究擬從分子水平觀察柴胡皂苷對大鼠肝纖維化細胞HSC-T6中TGFβ-Smad表達的影響，以探求其對肝纖維化治療作用的分子機制，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 細胞株大鼠肝星狀細胞系HSC-T6為第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院消化科惠贈，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院實驗室傳代保存。

1.2 藥物及試劑SSd（中國藥品生物制品檢定所，批號：110778-201409）；雌二醇（Sigma公司，批號：D0005215）；雌激素受體完全拮抗劑ICI182.780（TOCRIS公司，批號：S119108）；雌激素受體α特異性拮抗劑MPP、雌激素受體β特異性拮抗（R，R）-THC（TOCRIS公司產(chǎn)品，批號：4C/144820、5A/138659）。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（biosharp，批號：96030020）；牛血清白蛋白（BSA，美國Amresco公司，批號：21G1956242）；蛋白質(zhì)分子量預(yù)染Marker（Pierce公司，批號：00807539）；山羊抗兔HRP標(biāo) 記 二 抗（Cell Signaling公 司，批 號：AB2099233）；奶粉（上海光明公司，批號：080104）；Trizol抽 提 試劑盒（Invitrogen公司，批號：1382737）；ReverTra Ace-α-?Reverse Transcription Kit（Toyobo公司，批號：432300）；SYBR?Green Realtime PCR Master Mix（Toyobo公司，批號：656500）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Thermo Scientific公司，批號：2186802）；胎牛血清（FBS，奧地利PAA公司，批號：A15108-1479）。

1.3 實驗儀器V-5060型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；22R型低溫高速離心機（德國Heraeus公司）；TDL-5000B型低速冷凍離心機（上海世義精密儀器有限公司）；XW-80A型旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；SSC-24恒溫搖床，SSC-24恒溫搖床，AF10制冰機（美國SCOTSMAN公司）；垂直電泳儀（Bio-Rad Power/PAC 3000，美國Bio-Rad公司）；Quick-Reference imaging guide FluorChem?多功能顯像儀（美國Alpha Innotech公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)實驗選用對數(shù)生長期細胞，37℃、體積分數(shù)為5% CO2、完全飽和濕度條件下，使用DMEM完全培養(yǎng)基（含10%熱滅活胎牛血清），常規(guī)培養(yǎng)HSC-T6細胞。每48 h更換培養(yǎng)基，細胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底約80%后，以0.25%胰蛋白酶加0.02% EDTA消化傳代。

1.4.2 細胞干預(yù)1）常規(guī)消化對數(shù)生長期的大鼠肝星狀細胞HSC-T6，制備單細胞懸液，按每孔1×104/100μL接種于培養(yǎng)板中，24 h貼壁后干預(yù)。2）分為空白組（DMSO在37℃處理24 h），雌激素受體完全拮抗劑（FulvestrantICI182.780，ICI）組（用1μM ICI-182780在37℃處理24 h），雌激素受體α特異性拮抗劑｛（1，3-Bis-（4-hydroxyphenyl）-4-methyl-5-［4-（2-piperidinylethoxyphenol）-1H-pyrazole dihydrochloride，MPP］組（用1μM MPP在37℃處理24 h），雌激素受體β特異性拮抗［（R，R）-5，11-Diethyl-5，6，11，12-tetrahydro-2，8-chrysenediol THC］組（用1μM THC在37℃下處理24 h）。每組分為如下4個亞組：對照組（DMSO在37℃處理24 h，然后DMSO在37℃處理4 h）、模型組（DMSO在37℃處理24 h，然后在H2O2在37℃處理4 h）、SSd組（用5μM SSd在37℃處理24 h時，然后在37℃用H2O2處理4 h）、E2組（用1μM E2在37℃處理24 h，然后H2O2在37℃處理4 h）。每孔加入藥物，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔。

1.5 觀察指標(biāo)RT-PCR半定量檢測HSC-T6細胞TGFβ1、Smad3/7 mRNA的表達：Trizol法抽提細胞總RNA，進行RT-PCR擴增。擴增條件：94℃5 min，72℃延伸5 min。取RT-PCR產(chǎn)物4μL，加上樣緩沖液1μL，在1.5%瓊脂糖凝膠（含EB）上電泳，80 V，45 min，用UVP凝膠圖像成像系統(tǒng)，拍攝打印實驗結(jié)果，用凝膠圖像分析系統(tǒng)（Gel-Pro Analyzer Version 3.0）分析結(jié)果。求出每條條帶的密度值，以GAPDH PCR產(chǎn)物作為內(nèi)參照。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用ANOVA行單因素方差分析，并行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞總RNA的抽提鑒定紫外分光光度法分析HSC-T6細胞總RNA（Trizol法抽提所得）純度及濃度；瓊脂糖凝膠電泳確定RNA的完整性。結(jié)果表明，樣品A260/A280的值均介于1.6～2.0之間；RNA完整性保持良好。見圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠確定RNA完整性電泳圖

2.2 實時熒光定量RT-PCR擴增曲線和溶解曲線結(jié)果顯示，擴增曲線基線平整，起跳良好，溶解曲線形成單峰，說明引物特異性良好。見圖2。

圖2 實時熒光定量RT-PCR擴增曲線和溶解曲線圖

2.3 SSdHSC-T6細胞TGFβ1、smad3/7 mRNA水平的調(diào)節(jié)作用與空白組比較，模型組中TGFβ1、smad3、smad7 mRNA的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組TGFβ1表達升高（P＜0.05），SSd和E2能夠降低TGFβ1表達，此種作用可被ICI-182780和THC抑制，兩組TGFβ1mRNA表達與空白組對應(yīng)亞組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MPP對藥物的抑制作用不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Smad3在模型組中高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Smad3表達在SSd和E2處理后明顯降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），此種作用可被ICI-182780和THC抑制，兩組Smad3 mRNA表達與空白組對應(yīng)亞組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MPP對藥物的抑制作用不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與空白組比較，Smad7在模型組中均降低（P＜0.05）。SSd和E2能夠升高Smad7表達，同時ICI-182780和THC可抑制此種作用，兩組Smad7 mRNA表達與空白組對應(yīng)亞組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MPP對藥物的抑制作用不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3—5。

圖3 氧化應(yīng)激的HSC-T6細胞中TGFβ1表達

圖4 氧化應(yīng)激的HSC-T6細胞中Smad3表達

圖5 氧化應(yīng)激的HSC-T6細胞中Smad7表達

3 討論

肝纖維化發(fā)病是個非常復(fù)雜的動態(tài)過程，受外界刺激引起的細胞因子釋放，細胞與細胞外基質(zhì)相互作用等多種因素影響，導(dǎo)致大量纖維組織沉積于肝臟，最終形成肝纖維化［5-9］。抑制TGFβ1的表達這個靶點，在抗肝纖維化中有重要作用。正常情況下，TGFβ1表達極少，但肝損傷時其表達明顯增加。TGFβ1受體分為TGFβ1Ⅰ型受體（TβRⅠ）和TGFβ1Ⅱ型受體（TβRⅡ），均為跨膜糖蛋白，屬絲氨酸/蘇氨酸激酶型受體。TβR I與TβRⅡ自身激活體結(jié)合形成異源四聚體，磷酸化后活化，作用于胞漿Smads蛋白，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Smads蛋白由氨基端和羧基端的保守序列MH1（Mad—Homology domain1）、MH2及富含脯氨酸的連接區(qū)組成［10-11］。靜息Smad蛋白中，MH1與MH2相互抑制。MH1可與DNA結(jié)合，MH2與細胞核內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并調(diào)節(jié)TGFβ1，目標(biāo)基因的表達，Smads的連接區(qū)含有其他調(diào)節(jié)因子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。Smads蛋白按其結(jié)構(gòu)和功能分為3種亞型：1）受體調(diào)節(jié) 型Smads（R-Smads），包括對應(yīng)于TGFβ1和Activin的Smad2、3，和對應(yīng)于BMP的Sma dl、5、8；2）共同通路型Smad蛋白（Co-Smad），即Smad4；3）抑制型Smads（Ⅰ-Smads），包括分別對應(yīng)于TGFβ1、Activin的Smad7和 對 應(yīng) 于BMP的Smad6［12］。Smads蛋白家族，是現(xiàn)階段被確認為細胞內(nèi)唯一的TGFβ1，R1激酶底物，是TGFβ1由膜受體到內(nèi)目標(biāo)基因信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的中心環(huán)節(jié)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，SSd具有類雌激素樣作用，是一種雌激素受體調(diào)節(jié)劑［13-14］。這個現(xiàn)象提示我們將SSd的抗炎保肝作用與雌激素受體通路聯(lián)系起來。不可否認肝硬化臨床發(fā)病與性別有關(guān)，發(fā)病率男女性別之比約為2.6～3.6∶1，且絕大多數(shù)女性肝硬化患者為絕經(jīng)后婦女［15-16］，性別作為獨立的危險因子，可加快慢性肝病向肝硬化轉(zhuǎn)變的進程，顯示性激素對肝纖維化的發(fā)展起著重要的抑制作用。雌激素抗肝纖維化的相關(guān)研究資料證實，肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、枯否細胞和星狀細胞均存在雌激素受體；雌激素能夠改善受損肝臟的微循環(huán)，抑制活化的HSC的增殖和膠原的合成，促進肝細胞中抗氧化酶-GPx的活性，抗脂質(zhì)過氧化，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子等細胞因子表達等，抑制肝纖維化發(fā)生發(fā)展［17-22］。由此我們推測，SSd保肝抗炎、抗肝纖維化作用是通過雌激素受體途徑實現(xiàn)的。

本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)H2O2刺激后，HSC-T6細胞促纖維化指標(biāo)明顯增加，E2、SSd作用細胞24 h后，細胞內(nèi)TGFβ1、Smad3表達低于模型組，Smad7表達增多，起到抗纖維化進程的作用。此種作用可被ER完全拮抗劑和ERβ拮抗劑拮抗，提示SSd對纖維化細胞因子的影響可能是通過ER途徑發(fā)揮作用，并且主要通過ERβ亞型進行干預(yù)，此結(jié)果也驗證了我們的推測。

綜上所述，TGFβ-Smad通路在肝纖維化的形成及進展過程中發(fā)揮很大作用，可以促進HSC的增殖和活化，促進其分泌大量膠原，并減少膠原的降解導(dǎo)致大量膠原異常沉積，表現(xiàn)出促進肝纖維化的作用。而SSd通過雌激素受體途徑實現(xiàn)保肝抗炎、抗肝纖維化作用。