葉藝蘭,王志紅,劉建祥,王劍梅

(1.韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系 內(nèi)科,廣東 韶關(guān)512000;2.粵北人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科;3.韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 內(nèi)科)

我國每年胃癌發(fā)病人數(shù)約占世界發(fā)病總數(shù)的42%，嚴(yán)重威脅我國居民生命健康[1]。近年來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注中草藥對(duì)胃癌治療的應(yīng)用[2]。敗醬草在抗腸癌[3]、宮頸癌[4]、肝癌[5]、胃癌[6]等多種癌癥中均有報(bào)道，但其在抗腫瘤方面的具體作用機(jī)制尚不明確。本文通過分析敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，旨在為敗醬草有效成分用于治療胃癌提供理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人胃癌SGC-7901細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。SPF級(jí)別雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量200-230 g，購買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器(1)敗醬草總皂苷購買自成都瑞芬思生物科技有限公司；(2)酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司，流式細(xì)胞儀購買于Thermo Fisher，凝膠成像儀購買于Bio-Rad，澳洲胎牛血清購買于Thermo Fisher，CCK8試劑盒購買于日本同仁，細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)、自噬核心蛋白(Beclin-1)等抗體購買于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，脫脂奶粉購買于伊利公司，PBS、胰酶等購買于Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1敗醬草總皂苷含藥血清制備 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、敗醬草總皂苷低、中、高濃度組，每組9只，敗醬草總皂苷組參考文獻(xiàn)[7]予以50、100、150 mg/kg敗醬草總皂苷灌胃，對(duì)照組予以等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥2 h后，麻醉大鼠取血，分離血清，使用0.22 μm濾膜過濾分裝。

1.3.2人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901細(xì)胞置于10%澳洲胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至細(xì)胞生長80%左右進(jìn)行傳代培養(yǎng)，備用。

1.3.3MTT檢測(cè)敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長的影響 (1)收集對(duì)數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞用0.1%胰酶消化，用澳洲胎牛血清稀釋成濃度為5×(103-104個(gè)/ml)的單細(xì)胞懸浮液；(2)接種于96孔板中，每孔加入200 μl，分為對(duì)照組和藥物組(包括低濃度組、中濃度組和高濃度組)，對(duì)照組不加藥物，只加細(xì)胞，藥物組擬加入敗醬草總皂苷含藥血清，每組各設(shè)置3孔，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁；(3)接種后培養(yǎng)24 h，敗醬草總皂苷組分別加入200 μl不同濃度含藥血清，對(duì)照組加入200 μl含有10%澳洲胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；(4)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，每孔加入DMSO液150 μl，10 min后使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處吸光度值，重復(fù)三次，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，并根據(jù)細(xì)胞生長抑制率及含藥血清濃度制作曲線，計(jì)算IC50值。

1.3.4CCK8法檢測(cè)敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞培養(yǎng)和處理同1.3.3，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，每孔加入189 μl的CCK8試劑盒試劑，在37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處吸光度值，重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響 (1)收集各組細(xì)胞樣品，制成單細(xì)胞懸浮液，將細(xì)胞懸浮液移至1.5 ml離心管中；(2)1 000 r/min離心5 min，PBS清洗，預(yù)留0.5 ml PBS，加入1 ml預(yù)冷70%乙醇，4℃固定過夜；(3)輕輕刮動(dòng)離心管混勻細(xì)胞，加入5 μl核糖核酸酶A，37℃靜置1 h，加入50 μl濃度為100 μg/ml的PI，室溫避光染色30 min；(4)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相，分析細(xì)胞DNA含量，計(jì)算G1期、G2期以及S期細(xì)胞比例。

1.3.6Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá) (1)收集各組細(xì)胞樣品，提取總蛋白，保存于4℃冰箱備用；(2)SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白上樣電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育；(3)以1∶1比例混勻超敏發(fā)光液A、B，滴加至PVDF膜上，使用Bio-Rad凝膠成像儀采集信號(hào)、拍照，運(yùn)用ImageJ圖像分析軟件分析CyclinD1、CyclinE、CDK4、Beclin-1灰度值。

2 結(jié)果

2.1 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，敗醬草總皂苷含藥血清IC50值為119.72 μg/ml，且不同濃度敗醬草總皂苷對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長均具有抑制作用，抑制率隨血清濃度升高而增大。見表1。

表1 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長的影響

2.2 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

藥物組培養(yǎng)24、48、72 h的OD值均低于對(duì)照組(P<0.05)，OD值高濃度組<中濃度組<低濃度組(P<0.05)。見表2。

表2 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

2.3 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響

與對(duì)照組比較，藥物組細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.05)，G2期、S期細(xì)胞百分比明顯降低(P<0.05)，細(xì)胞百分比隨著血清濃度升高、降低而增加、減少(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響

表3 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響

2.4 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，藥物組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CyclinE、CDK4蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，高濃度組<中濃度組<低濃度組；Beclin-1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，高濃度組>中濃度組>低濃度組。見表4，圖2。

表4 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

圖2 敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞周期

3 討論

胃癌是一種全球高發(fā)的惡性腫瘤疾病，患者五年生存率低于25%，手術(shù)治療效果不佳且傳統(tǒng)放化療副作用大，患者生存質(zhì)量差，隨著惡性腫瘤治療進(jìn)入分子靶向時(shí)代，中醫(yī)的辨證論治在當(dāng)代精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療中也有了新應(yīng)用[8]。中醫(yī)所謂熱毒內(nèi)蘊(yùn)與胃癌的發(fā)生有密不可分的關(guān)系[9]。因此胃癌的主要病機(jī)特點(diǎn)為正虛為本，濕毒瘀滯胃脘為標(biāo)，故在胃癌的治療上，主要以化濕解毒為主[10]。敗醬草最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其全草入藥，可與其他中藥藥方配伍用于治療多種腫瘤疾病[11]。研究顯示，百花敗醬草有效部位對(duì)人子宮鱗癌細(xì)胞有明確抑制作用，與其作用濃度及作用時(shí)間有關(guān)[12]。研究還顯示，敗醬草總皂苷能夠抑制U14宮頸癌小鼠生長，并通過提高免疫功能以及抗氧化能力發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。丁芮等[14]報(bào)道表明，敗醬草可降低大腸癌5-FU耐藥細(xì)胞株細(xì)胞活力，且敗醬草濃度越高，細(xì)胞活力越低。

本文研究結(jié)果顯示，敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，隨著藥物濃度升高，抑制作用越強(qiáng)[12,14]。細(xì)胞無限增殖是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特征之一，細(xì)胞增殖又主要通過細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)[15]。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)既能夠影響細(xì)胞分裂，還能夠影響細(xì)胞凋亡，而凋亡相關(guān)信號(hào)通路在細(xì)胞死亡前又可誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯，故細(xì)胞周期調(diào)控失常是腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展的重要因素[16]。G1期和S期是細(xì)胞周期調(diào)控的重要節(jié)點(diǎn)，受到細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶等蛋白調(diào)控[17]。CyclinD1、CyclinE、CDK4是細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵蛋白，Beclin-1蛋白可與CyclinD選擇性結(jié)合，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖[18-19]。本文研究結(jié)果顯示，藥物組細(xì)胞G1期細(xì)胞百分比明顯升高，高濃度組>中濃度組>低濃度組；G2期、S期細(xì)胞百分比明顯降低，高濃度組<中濃度組<低濃度組，表明敗醬草總皂苷含藥血清可使人胃癌SGC-7901細(xì)胞阻滯于G1期，有效抑制細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本文研究結(jié)果還顯示，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CyclinE、CDK4蛋白表達(dá)水平高濃度組<中濃度組<低濃度組<對(duì)照組，Beclin-1蛋白表達(dá)水平高濃度組>中濃度組>低濃度組>對(duì)照組，表明敗醬草總皂苷含藥血清下調(diào)了CyclinD1、CyclinE、CDK4蛋白表達(dá)，上調(diào)了Beclin-1蛋白表達(dá)，并且與血清濃度呈依賴關(guān)系。因此，敗醬草總皂苷含藥血清對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制機(jī)制可能與影響細(xì)胞周期及其相關(guān)蛋白水平相關(guān)。

綜上所述，敗醬草總皂苷含藥血清可能起到抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制可能與干預(yù)細(xì)胞周期，影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)，通過阻斷細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，最終發(fā)揮抗癌作用。