劉霽萱，李詠梅

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林132013)

宮頸癌是全球女性發(fā)病和死亡的常見(jiàn)原因，僅在2020年就報(bào)告了604，000例新診斷病例和約342，000例死亡[1]。目前，許多用于癌癥治療的放療方法和化學(xué)藥物副作用較為嚴(yán)重，但隨著人們對(duì)中草藥了解的不斷深入，發(fā)現(xiàn)中藥的一些有效成分具有許多優(yōu)點(diǎn)，如多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多通道、毒性小等特點(diǎn)為抗癌藥物的研發(fā)提供了新的思路與新靶點(diǎn)[2]。丹參在亞洲被用作傳統(tǒng)中藥已有數(shù)千年的歷史。丹參酮IIA(TanIIA)作為其最豐富的有效成分之一，對(duì)于許多心血管、神經(jīng)、呼吸、泌尿、消化和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮治療作用，并且對(duì)抑制癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和自噬，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等也有顯著的作用[3]。以往有研究表明[4]，丹參酮IIA可抑制含有HPV18陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞增殖，但對(duì)于HPV16陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞的抑制作用仍在探索階段。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑樘剿鞑煌瑵舛鹊⑼狪I A作用于人宮頸鱗癌Siha細(xì)胞后對(duì)增殖、侵襲及代謝的影響及其可能的誘導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和藥物

人宮頸鱗狀癌細(xì)胞Siha購(gòu)于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技公司。丹參酮ⅡA購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，為化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 主要試劑

CCK-8試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、DEPC水均購(gòu)于上海碧云天有限公司；Transwell小室、Matrigel膠，美國(guó)Corning公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒，美國(guó)BD生物公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，Gibco公司；胎牛血清(FBS)，GEMINI公司；葡糖糖測(cè)定試劑盒、乳酸測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗人PKM2、STAT3、Cyclin D1、Bcl-xl、MMP-2、MMP-9和GAPDH單克隆抗體以及抗兔二抗均購(gòu)自于ABclonal公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱(Form311)，Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀(Infinite M1000 Pro),TECAN公司；倒置顯微鏡(IX83)，奧林巴斯公司；流式細(xì)胞儀(EXFLOW-206)，達(dá)科為公司；凝膠成像儀(GelDoc EZ),PCR儀(T100TM)，Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌Siha細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中。每2天更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度80%-90%左右，進(jìn)行傳代或凍存。

1.4.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Siha細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80%-90%左右，0.25%胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照1.0×105/ml濃度接種于96孔板中，每孔加入200 μl細(xì)胞混懸液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后棄去培養(yǎng)液，設(shè)置對(duì)照組和不同濃度加藥組，加藥組分別加入含TanⅡA(0.5、1、2、4、8、16 mg/L)濃度的培養(yǎng)液100 μl，藥物刺激24 h，對(duì)照組不做藥物處理，只加入相同體積培養(yǎng)液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。24 h后顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每孔避光加入10 μl CCK-8溶液，放置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。1 h后，取出96孔板并使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm處各孔的OD值。

1.4.3劃痕實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Siha細(xì)胞，待其長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿80%-90%，0.25%胰酶消化，按照3×105個(gè)細(xì)胞每孔數(shù)量接種于6孔板中，每孔3 ml，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用200 μl槍頭對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕處理，用PBS洗滌細(xì)胞三次，將劃下的貼壁細(xì)胞洗去，實(shí)驗(yàn)組每孔加入不同濃度TanⅡ A(1 、2、4 mg/L)與培養(yǎng)基混合液，對(duì)照組不做藥物處理，只加入相同體積培養(yǎng)液，每孔3 ml，輕輕搖勻。每孔任意選擇3個(gè)不同視野，做好標(biāo)記，倒置顯微鏡下觀察劃痕情況并拍照(0 h)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后同一視野再次拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 稀釋Martrigel膠(Martrigel膠∶無(wú)血清培養(yǎng)基=1∶8)，將稀釋好的基質(zhì)膠覆蓋在小室的上室，每孔100 μl，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱4小時(shí)，等待其凝固。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Siha細(xì)胞，按照每孔0.5×103個(gè)細(xì)胞，200 μl的體積接種于上層小室中，加入不同濃度的丹參酮II A(1、2、4 mg/L)進(jìn)行藥物刺激，對(duì)照組不做藥物處理。下室加入500 μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基以誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出上室，用棉簽擦拭小室中未侵襲的基質(zhì)膠和細(xì)胞，棄下室培養(yǎng)液，使用4%多聚甲醛室溫固定15 min，棄固定液。然后加入500 μl結(jié)晶紫染色液室溫避光染色15 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，洗除未與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫。適當(dāng)晾干后顯微鏡下拍照，使用Image J來(lái)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞侵襲數(shù)量。

1.4.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集90%滿的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Siha細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度3×105個(gè)/孔,均勻接種于6孔板中，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度的丹參酮II A(1、2、4 mg/L)與培養(yǎng)基混合液進(jìn)行藥物刺激，每孔3 ml，對(duì)照組不做藥物處理，加入相同體積培養(yǎng)液。計(jì)算時(shí)間，24 h后收集細(xì)胞，用無(wú)EDTA胰酶消化細(xì)胞后，加入15 ml離心管內(nèi)，1 000 rpm，離心5 min，棄上清，PBS清洗兩次，加入PBS重懸細(xì)胞，再次離心，1 000 rpm，離心5 min，棄上清，用高壓后的去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×Binding Buffer，加入400 μl重懸細(xì)胞，然后加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，加入10 μl PI，冰上避光孵育5 min，上機(jī)檢測(cè)，調(diào)電壓，采集細(xì)胞凋亡圖譜。

1.4.6Western blot檢測(cè) 不同濃度TanⅡA處理細(xì)胞24 h后，離心收集細(xì)胞，加入預(yù)先配置好的RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，冰上裂解30 min，4℃下12 000 rpm，離心12 min，收集上清，提取細(xì)胞蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇12%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行配制，上樣，SDS-PAGE電泳，80V電泳30 min，待Marker跑至分離膠，調(diào)整為120V繼續(xù)電泳，觀察條帶達(dá)到凝膠1/3-2/3處時(shí)可停止電泳。濕轉(zhuǎn)法至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，260 mA，約1.5-2 h，將膜放入封閉液TBST(含5%BSA)中，室溫?fù)u床封閉1-2 h。加入稀釋一抗(PKM2、STAT3、Bcl-xl、MMP-2均為1∶1000)，置于搖床4℃過(guò)夜。1×TBST洗滌3次，每次5-10 min。加入HPR標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，孵育結(jié)束后再次進(jìn)行洗膜，5-10 min，共洗滌3次。ECL顯影，掃描記錄。以GAPDH表達(dá)量為對(duì)照觀察結(jié)果。

1.4.7葡萄糖攝取量及乳酸含量測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Siha細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度1×105個(gè)/ml進(jìn)行鋪板，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后按照不同濃度(0、1、2、4 mg/L)分組加入藥物同時(shí)設(shè)置無(wú)細(xì)胞組以檢測(cè)單純培養(yǎng)基數(shù)值，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱24 h后收集細(xì)胞，1 000 rpm，離心10 min，取上清，按照葡萄糖檢測(cè)試劑盒以及乳酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，乳酸含量測(cè)定同時(shí)將空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管的測(cè)量值分別設(shè)置為A、B、C。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按照以下公式計(jì)算。

葡萄糖含量(mmol/L)=(△A測(cè)定-△A空白)/(△A標(biāo)準(zhǔn)-△A空白)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mmol/L)×樣品稀釋倍數(shù)。

每組葡萄糖消耗值(mmol/L)=單純培養(yǎng)基所測(cè)數(shù)值-各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基所測(cè)數(shù)值。

乳酸含量(mmol/L)=(C值-B值)/(A值-C值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.4.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用GraphPad Prism 9軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和數(shù)據(jù)整合，組間差異用單因素One-Way ANOVA分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測(cè)丹參酮Ⅱ A對(duì)Siha細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果可見(jiàn)，丹參酮II A作用于Siha細(xì)胞24 h后，Siha細(xì)胞的增殖抑制率隨丹參酮II A濃度的增加而逐漸升高，與未加藥組比較，差異顯著，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)Siha細(xì)胞增殖的影響

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)丹參酮Ⅱ A對(duì)Siha細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未加藥組向劃痕中央移動(dòng)速度較快，而相較于1、2 、4 mg/L丹參酮ⅡA藥物刺激24小時(shí)后，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞愈合速度減慢，細(xì)胞遷移能力下降。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞遷移的影響

2.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)丹參酮Ⅱ A對(duì)Siha細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TanⅡA作用于Siha細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，1、2、4 mg/L濃度組的Siha細(xì)胞侵襲能力逐漸減弱，能夠穿過(guò)人工基底膜的Siha細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表2。

圖2 不同濃度丹參酮Ⅱ A對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞侵襲能力的影響

表2 各組細(xì)胞侵襲數(shù)量比較

2.4 Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)丹參酮Ⅱ A作用于Siha細(xì)胞凋亡的情況

結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，TanⅡA作用后明顯引起細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率上升顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)Siha細(xì)胞凋亡的影響

2.5 Tan ⅡA不同濃度對(duì)Siha細(xì)胞內(nèi)PKM2、STAT3、Bcl-xl、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度加藥組作用于Siha細(xì)胞24 h后PKM2、STAT3、蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào),Bcl-xl、MMP-2蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào)，并且隨著藥物濃度的升高，蛋白表達(dá)逐漸下降，呈劑量依賴性。如圖3。

圖3 各組Siha細(xì)胞內(nèi)PKM2、STAT3、bcl-xl、MMP-2蛋白表達(dá)比較

2.6 丹參酮Ⅱ A作用于Siha細(xì)胞后對(duì)葡萄糖攝取量的影響

不同濃度丹參酮ⅡA作用于Siha細(xì)胞24 h后進(jìn)行葡萄糖含量檢測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著TanⅡA劑量增加，葡萄糖攝取量減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)Siha細(xì)胞葡萄糖攝取量的影響

2.7 檢測(cè)丹參酮Ⅱ A作用于Siha細(xì)胞后對(duì)乳酸生成含量的影響

檢測(cè)結(jié)果表明，丹參酮Ⅱ A對(duì)Siha細(xì)胞的抑制作用隨劑量增大乳酸生成含量逐漸減少，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表5。

表5 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)Siha細(xì)胞乳酸生成含量的影響

3 討論

宮頸癌是全球女性中最普遍的癌癥之一，在全世界范圍內(nèi)受到廣泛重視，目前的治療策略主要包括外科手術(shù)、放療和化療，然而腫瘤細(xì)胞逐漸對(duì)各種化療藥物產(chǎn)生耐藥，并且伴隨一些副作用和毒性，使腫瘤患者生活質(zhì)量大幅降低，因此仍需要尋找新的防治策略和方法來(lái)減輕患者痛苦、降低宮頸癌患者死亡率。本研究針對(duì)宮頸鱗癌Siha細(xì)胞，探討TanⅡ A對(duì)其增殖、代謝及凋亡有關(guān)的分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，丹參酮Ⅱ A對(duì)于宮頸癌Siha細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲有一定的抑制作用，并且可以誘導(dǎo)Siha細(xì)胞凋亡。

正常細(xì)胞只有在缺氧的情況下進(jìn)行糖酵解，而腫瘤細(xì)胞即使在不缺氧的情況下也優(yōu)先進(jìn)行糖酵解，消耗更多的葡萄糖和產(chǎn)生更多的乳酸。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，TanⅡ A作用后，Siha細(xì)胞葡萄糖攝取量與乳酸生成含量減少，這提示了TanⅡ A對(duì)其糖酵解產(chǎn)生影響。

報(bào)道顯示，2008年Lewis C.Cantley[5]通過(guò)移植瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PKM2具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。在 2013年，Matthew Vander Heiden團(tuán)隊(duì)[6]的研究采用了敲除PKM基因中PKM2特有的第十個(gè)外顯子的策略，發(fā)現(xiàn)PKM2的缺失反而會(huì)加速腫瘤的生長(zhǎng)。2018年Nobuhiro Tanuma團(tuán)隊(duì)[7]構(gòu)建了新的基因敲除小鼠模型，分別以和內(nèi)源PKM表達(dá)接近的水平在小鼠中只表達(dá)PKM1或者PKM2亞型。結(jié)果顯示，在致癌劑或癌基因誘導(dǎo)等多種腫瘤模型中，PKM1都促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)，而PKM2則抑制腫瘤生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)[8]，丙酮酸激酶M2激活劑促進(jìn)四聚體形成并抑制腫瘤發(fā)生，PKM2與含磷酸酪氨酸的蛋白質(zhì)相互作用，抑制酶活性并增加糖酵解代謝物的可用性以促進(jìn)細(xì)胞增殖，這表明高丙酮酸激酶活性可能抑制腫瘤生長(zhǎng)。PKM2的小分子激活劑可能通過(guò)干擾合成代謝來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tan ⅡA作用于宮頸癌Siha細(xì)胞后，PKM2與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子STAT3的蛋白表達(dá)增加，提示了Tan ⅡA 對(duì)PKM2有促表達(dá)作用，若按照Nobuhiro Tanuma[7]團(tuán)隊(duì)推測(cè)，PKM2可抑制腫瘤生長(zhǎng)，并且PKM2的小分子激活劑可能通過(guò)干擾合成代謝來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。那么Tan ⅡA發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制可能是其作為小分子藥物對(duì)PKM2有激活作用，從而干擾了合成代謝，抑制了宮頸癌Siha細(xì)胞的增殖。

另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，抗凋亡蛋白Bcl-xl的過(guò)度表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，從而使細(xì)胞增殖數(shù)量和凋亡數(shù)量不平衡，即使細(xì)胞增殖能力沒(méi)有改變，但由于凋亡細(xì)胞數(shù)量的減少，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多[9]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性的誘導(dǎo)有助于細(xì)胞間連接的解體和ECM的降解，從而克服細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的物理限制，參與腫瘤侵襲，因而是抗腫瘤藥物的靶標(biāo)[10]。本研究結(jié)果表明，Tan ⅡA作用于Siha細(xì)胞后，Bcl-xl和MMP-2的蛋白表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，表明TanⅡA抑制Siha細(xì)胞的遷移、侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與抑制MMP-2和Bcl-xl蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上，丹參酮ⅡA能夠?qū)m頸鱗癌Siha細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力發(fā)揮抑制作用，并且誘導(dǎo)Siha細(xì)胞凋亡。推測(cè)發(fā)揮作用的機(jī)制可能是丹參酮ⅡA作為小分子藥物激活了PKM2的活性，通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞糖酵解干擾了合成代謝，影響其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子STAT3和抗凋亡蛋白Bcl-xl從而發(fā)揮抗腫瘤作用，并且通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達(dá)抑制Siha細(xì)胞的遷移和侵襲能力。但是，丹參酮ⅡA是如何激活了PKM2，還對(duì)糖酵解過(guò)程中合成代謝的哪些關(guān)鍵步驟發(fā)揮作用，以及其發(fā)揮作用的通路和上游分子仍有待深入研究和探討。