張 瑩,趙 婷，馬 靜

(解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學中心 國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心,北京100853)

單羧酸轉運蛋白(MCT)是溶質載體16(SLC16)家族成員，對于短鏈單羧酸鹽、激素、營養(yǎng)素和氨基酸的運輸至關重要。MCT家族共有16個成員，分別是MCT1-14和2個鈉離子依賴的MCT成員SMCTs 1/2,SLC5A8/12。MCT 1-4 是質子依賴的轉運蛋白，對于糖酵解產物(如乳酸和丙酮酸)以及酮體(如乙酰乙酸和β-羥基丁酸)的跨膜運輸發(fā)揮關鍵作用[1]。生理條件下MCT1-4協(xié)同形成乳酸穿梭系統(tǒng)，維持糖酵解細胞和氧化細胞之間的乳酸穩(wěn)態(tài)。從糖酵解細胞輸出的乳酸被氧化細胞吸收用于有氧代謝，例如骨骼肌中的白色糖酵解細胞和紅色氧化細胞之間以及大腦中的星形膠質細胞和神經元之間的乳酸穩(wěn)態(tài)[2]。研究表明MCT1/2/4參與腫瘤的代謝過程[3]，糖酵解(glycolytic)型癌細胞依靠糖酵解來適應低氧環(huán)境，分解葡萄糖排出乳酸，而氧化型(oxidative)癌細胞則攝取糖酵解癌細胞分泌的乳酸作為能量來源，這是一種“代謝共生”現(xiàn)象，其中MCT1、4發(fā)揮最重要的作用[4]。除了直接參與代謝外，乳酸能夠作為一種信號分子刺激腫瘤血管內皮細胞的增生[5]，促進腫瘤細胞產生免疫耐受[6]等。

目前針對MCT1已有相應的抑制劑，例如AZD3965、BAY-8002和7ACC2等，其中AZD3965正在進行Ⅰ期臨床試驗。而MCT4尚無有效的抑制劑，本文利用大腸桿菌生物合成MCT4的siRNA并初步驗證了其抑制作用。

1 材料與方法

1.1 利用大腸桿菌表達siRNA

以大腸桿菌tRNA為支架，將MCT4siRNA前體序列插入tRNA的環(huán)形序列中，形成帶有MCT4前體發(fā)卡狀siRNA的環(huán)狀結構，插入原核表達載體中進行表達，表達產物進行HPLC純化后用于后續(xù)研究(圖1)。MCT4siRNA序列，Sense:CGAGACAACGUGACUUUAATT,Antisense:UUAAAG-UCACGUUGUCUCGTT。

1.2 細胞培養(yǎng)

人卵巢癌細胞株SKOV3和A2780為本室保存，經STR鑒定正確。細胞在含有10%胎牛血清(GIBCO,NY,USA)和1%的青鏈霉素(GIBCO,NY,USA)的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO,NY,USA)中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。siRNA細胞轉染采用脂質體轉染試劑lipofectamin2000(Invitrogen，CA，USA)。

1.3 RNA分離和實時定量PCR(RT-PCR)

使用總RNA試劑盒提取試劑盒(TaKaRa Bio,Otsu,Japan)從培養(yǎng)細胞中提取總RNA，并使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa Bio,Otsu,Japan)生成互補DNA(cDNA)。定量RT-PCR利用SYBR Green PCR master mix(TaKaRa Bio,Otsu,Japan)在實時定量PCR儀上進行，反應條件為：95℃10min，然后95℃ 30 s，57℃ 1 min，72℃ 1 min循環(huán)30次，以GAPDH作為PCR產物定量和標準化的對照。引物序列，MCT4-上游:5’-CAGTTCGAGGTGCTCATGG-3’，MCT4-下游:5’-ATGTAGACGTGGGTCGCATC-3’;GAPDH-上游:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’ GAPDH-下游:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3。

1.4 Western blot

用RIPA裂解緩沖液(白鯊生物，合肥)制備細胞提取物，并在4℃下以13 000×g離心30 min。然后用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質樣品并轉移到PVDF膜上(Millipore Corporation,MA,USA)。在室溫下用5%牛奶封閉1小時后，4℃下用一抗孵育膜過夜。然后與HRP結合的二抗孵育，使用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行檢測。

1.5 細胞活力測定

將MCT4siRNA轉染卵巢癌細胞，在24、48、72及96小時后使用CCK8檢測試劑盒(Bimake，TX，USA)對細胞進行活性檢測。每個孔中的細胞在37℃下與10 μl CCK8工作溶液孵育2小時。使用Epoch微孔板讀取器(BIO-TEK,VT,USA)測量每個孔在450 nm處的吸光度。

1.6 代謝分析

細胞經siRNA處理后，裂解，上清使用葡萄糖分析試劑盒(Biovision,CA，USA)測定葡萄糖攝取量。用乳酸測定試劑盒(Biovision,CA，USA)檢測細胞乳酸含量。使用細胞耗氧量檢測kit細胞(BD Biosciences,San Jose,CA)的耗氧率，所有操作按照說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準值表示，使用GraphPadPrism v8.0軟件進行處理。治療組與對照組之間進行t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物合成的MCT4siRNA制備

將MCT4的siRNA前體插入tRNA骨架后形成tRNA-siRNA結構，命名為Bio-siMCT4 ，設計及生產流程如圖1所示。Bio-siMCT4在大腸桿菌合成后經HPLC純化可以獲得高純度的 siRNA(圖2)，產量為1.6 mg/L。

圖1 生物合成的MCT4siRNA制備流程

圖2 生物合成的MCT4siRNA純化

2.2 生物合成的MCT4 siRNA能有效抑制MCT4的表達

Bio-siMCT4轉染細胞后檢測MCT4的表達，RT-PCR和Western blot顯示Bio-siMCT4能有效降低 MCT4的核酸和蛋白水平，與化學合成的siRNA相比具有更高的效率(圖3)。

圖3 Bio-siMCT4對MCT4的抑制作用

2.3 生物合成的MCT4 siRNA抑制卵巢癌細胞的糖酵解及細胞增殖作用

將MCT4siRNA轉入卵巢癌細胞中，檢測葡萄糖攝取、糖酵解速率、乳酸生成以及細胞耗氧量，以評估卵巢癌細胞的糖酵解及氧化磷酸化水平。結果顯示生物及化學合成的MCT4 siRNA均能抑制卵巢癌細胞的糖酵解，促進細胞的氧化磷酸化，但是生物合成的siRNA效果更好(圖4)。細胞增殖實驗證明生物及化學合成的MCT4 siRNA均能抑制卵巢癌細胞的增殖，生物合成的siRNA效果更好(圖5)。

圖4 Bio-siMCT4對卵巢癌細胞糖酵解的抑制作用

圖5 Bio-siMCT4對卵巢癌細胞增殖的抑制作用

3 討論

核酸藥物是重要的一類生物藥物，能夠作用于基因、轉錄本、蛋白質、小分子，特別是對于傳統(tǒng)藥物難以成藥的靶點具有重要的價值。RNA藥物種類主要有mRNA、小RNA、反義核酸及RNA適配體等。mRNA疫苗在新型冠狀病毒的防疫中發(fā)揮了極為重要的作用[7]，其也可以通過編碼治療蛋白抗原用以免疫細胞治療。小RNA包括siRNA、MiRNA，與反義核酸作用類似，主要用于抑制致病性RNA活性。RNA適配體能夠結合蛋白質，發(fā)揮調節(jié)蛋白活性的作用。Pegaptanib作為結合VEGF的RNA適配體在2004年獲批上市用于治療老年濕性黃斑變性(Neovascular AMD)，是第一個獲得FDA批準的核酸藥物[8]。此后靶向ApoB100、肌萎縮蛋白dystrophin51外顯子、脊髓性肌萎縮致病基因SMN2及TTR基因用于高脂血癥(HoFH)、假性肥大型肌營養(yǎng)不良(DMD)、脊髓性肌萎縮癥(SMA)及hATTR淀粉樣變性的寡核苷酸藥物Mipomersen[9]、Eteplirse[10]、Nusinersen[11]和Inotersen[12]獲批上市。隨著siRNA技術的發(fā)展，siRNA藥物也得到迅速發(fā)展，目前已有三種siRNA藥物獲得FDA批準，分別是靶向羥基酸氧化酶1(HAO1)治療原發(fā)性高草酸尿癥1型(PH1)的Lumasiran[13]，靶向氨基乙酰丙酸合成酶1(ALAS1)用于治療急性肝卟啉癥(AHP)的Givosiran[14]以及靶向TTR基因用于治療hATTR淀粉樣變性的Patisiran[15]。

核酸藥物在早期并不為人們所重視，主要原因是RNA藥物成本高、容易降解，半衰期短。小RNA及寡核苷酸藥物通常是化學合成，通過堿基修飾提高藥物的穩(wěn)定性，利用納米材料提高其半衰期及靶向性。生物合成的小RNA技術將小RNA前體插入核糖體tRNA支架中，在大腸桿菌表達，由于tRNA在大腸桿菌表達豐度極高，可以高效表達小RNA前體。tRNA-siRNA進入細胞后siRNA前體經切割形成活性RNA從而發(fā)揮作用。與化學合成的siRNA相比，生物合成的siRNA成本極低，未經過體外修飾，活性更好，具有良好的應用前景[16]。本實驗選擇卵巢癌的MCT4作為藥物靶點，設計、表達合成了針對該分子的生物合成的siRNA，結果顯示Bio-siMCT4能夠顯著抑制MCT4在卵巢癌細胞中的表達，并顯著抑制卵巢癌細胞的糖酵解水平和細胞增殖。與化學合成的siRNA相比，Bio-siMCT4具有更好的活性。實驗表明，生物合成的MCT4siRNA對于卵巢癌細胞具有良好的治療作用，具有新RNA藥物的成藥潛質。