王 悅，金 洋

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科；2.核醫(yī)學(xué)科，湖北 十堰442000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者若不接受規(guī)范化治療，大部分會(huì)出現(xiàn)全身多關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞，導(dǎo)致功能喪失，甚至可致殘[1]。研究顯示[2]，關(guān)節(jié)病已成為女性致殘者的首要致殘疾病，并且RA致殘占其中的79.4%，給家庭和社會(huì)造成了極大負(fù)擔(dān)。目前，RA的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。一直以來(lái)，免疫系統(tǒng)異常被認(rèn)為是介導(dǎo)RA發(fā)病的重要機(jī)制[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4]，CD4+T細(xì)胞在風(fēng)濕性疾病患者中表達(dá)異常，可能參與了風(fēng)濕性疾病的免疫病理過(guò)程，這可能成為風(fēng)濕性疾病治療的重要靶點(diǎn)。其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與效應(yīng)性T細(xì)胞可相互調(diào)節(jié)，它們的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的維持有著重要作用，二者在感染性疾病中的研究較多[5-6]。本研究對(duì)RA患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平進(jìn)行檢測(cè)，分析CD4+T細(xì)胞亞群水平與疾病活動(dòng)度的關(guān)系，探討其臨床檢測(cè)意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年6月—2021年6月本院收治的RA患者70例，其中男19例，女51例，年齡41-72(60.51±10.23)歲。詳細(xì)記錄患者C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(CCP抗體)及DAS28評(píng)分等臨床資料。入組患者均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，均存在不同程度病情活動(dòng)，近3個(gè)月內(nèi)無(wú)激素使用史；并排除合并其他自身免疫性疾病，嚴(yán)重心肝腎功能不全，合并其他風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病，合并急慢性感染，伴惡性腫瘤等。同時(shí)根據(jù)DAS28評(píng)分[8]將RA患者分為輕度活動(dòng)期組(2.6≤DAS28<3.2，n=21)、中度活動(dòng)期組(3.2≤DAS28<5.1，n=26)和重度活動(dòng)期組(DAS28≥5.1，n=23)。另選取性別、年齡與RA組相匹配的健康體檢者50名作為對(duì)照組，其中男20例，女30例，年齡40-70(47.68±8.69)歲。兩組性別、年齡對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑

疊氮碘化丙啶刺激劑PMA(美國(guó)Sigma公司)，高爾基阻斷劑(美國(guó)Sigma公司)，磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，離子霉素(聯(lián)科生物)，1640液體(美國(guó)Sigma公司)；溶血素(美國(guó)BD公司)，Trucount(美國(guó)BD公司)，單克隆抗體CD4-異硫氰酸熒光素TITC(美國(guó)BD公司)，低溫離心機(jī)(北京醫(yī)用離心廠)，Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)等。

1.3 外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平的測(cè)定

(1)細(xì)胞培養(yǎng)、標(biāo)記：采集80 μl抗凝血，依次予以PMA(30 ng/ml)10 μl、離子霉素(750 ng/ml)10 μl、高爾基阻斷劑1 μl添加，于CO2培養(yǎng)箱37℃下刺激5 h。將細(xì)胞分裝于一號(hào)、二號(hào)兩管中，予以CD4-FITC加入，于避光環(huán)境下，室溫孵育30 min，添加Permaeabilization/Fixation液1 ml，經(jīng)渦旋混勻后，孵育30 min，然后一號(hào)管予以IL-4-PE和IFN-γ-APC加入，二號(hào)管予以人抗人IL-17-PE加入，室溫下孵育30 min。(2)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)記：采集 80 μl抗凝血，予以CD25-APC、CD4-FITC加入，避光，室溫孵育30 min，予以Permaeabilization/Fixation液1ml加入，經(jīng)渦旋混勻后，在4℃環(huán)境下孵育30 min，予以Foxp3抗體加入，室溫孵育30 min，采用PBS進(jìn)行洗滌，然后上機(jī)檢測(cè)。(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并計(jì)算Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RA患者與健康對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平比較

相比健康對(duì)照組，RA患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平顯著降低，Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 RA患者與健康對(duì)照組外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平比較

2.2 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與RA患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示，RA患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平與DAS28(r=-0.348)、ESR(r=-0.312)、抗CCP(r=-0.321)呈負(fù)相關(guān)，Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與DAS28(r=0.336)、ESR(r=0.348)、抗CCP(r=0.325)呈正相關(guān)，但均與CRP無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 調(diào)節(jié)性細(xì)胞、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與RA患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性

2.3 不同疾病活動(dòng)度RA患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平比較

三組Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，重度活動(dòng)期組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平顯著低于輕度活動(dòng)期組(P<0.05)，而Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值顯著高于輕度活動(dòng)期組(P<0.05)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值在輕度活動(dòng)期組與中度活動(dòng)期組、中度活動(dòng)期組與重度活動(dòng)期組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同疾病活動(dòng)度RA患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平比較

3 討論

RA所引起的滑膜炎是導(dǎo)致人永久傷殘的疾病之一，可累及全身多關(guān)節(jié)，具有侵襲性[9]。所以對(duì)于RA活動(dòng)度的臨床評(píng)估和有效治療尤為重要。RA的發(fā)病與機(jī)體免疫功能異常有關(guān)，而T細(xì)胞異?；罨恢北徽J(rèn)為是RA發(fā)病的關(guān)鍵因素，RA患者普遍存在T細(xì)胞亞群異常改變[10]，故臨床RA治療藥物如來(lái)氟米特、甲氨蝶呤均是基于此機(jī)制，旨在抑制T細(xì)胞活化，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群比例的恢復(fù)[11]。檢測(cè)RA患者機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群比例變化，探討其臨床意義，有助于深入了解RA的發(fā)病機(jī)制，為臨床診治提供指導(dǎo)。

CD4+T細(xì)胞亞群參與著維持機(jī)體免疫耐受過(guò)程，對(duì)抵抗病原體有重要作用，T淋巴細(xì)胞亞群比例失衡可促進(jìn)自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。Th1細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵細(xì)胞，能夠分泌白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IFN-γ等多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答[13]。Th2細(xì)胞能夠分泌IL-6、IL-10等一系列細(xì)胞因子，輔助B細(xì)胞增殖，而參與體液免疫反應(yīng)[14]。近年研究發(fā)現(xiàn)[15]，Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是自身免疫性疾病的重要參與者，其中Th17細(xì)胞可分泌IL-17、IL-23等多種細(xì)胞因子，而參與自身免疫疾病和慢性炎癥疾病的發(fā)病[16]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能夠通過(guò)控制不良免疫反應(yīng)過(guò)程來(lái)維持機(jī)體正常免疫耐受，能夠抑制免疫防御過(guò)程中T、B細(xì)胞的異?；罨瑥亩鴾p輕組織損傷[17]。故研究Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的平衡變化對(duì)于深入了解RA等免疫相關(guān)性疾病的發(fā)病機(jī)制有著重要意義。本研究對(duì)RA患者外周血CD4+T細(xì)胞亞群水平(包括Th1、Th2、Th17、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相比健康對(duì)照組，RA患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平顯著降低，Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值顯著增高，且RA患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平與DAS28、ESR、抗CCP呈負(fù)相關(guān)，Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與DAS28、ESR、抗CCP呈正相關(guān)，這與zhang等[18]研究報(bào)道一致，提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平降低可能參與了RA的發(fā)病過(guò)程，其所致的免疫耐受下降可能是重要發(fā)病機(jī)制。

同時(shí)本研究還顯示，重度活動(dòng)期組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平顯著低于輕度活動(dòng)期組，而Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值顯著高于輕度活動(dòng)期組，提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平與RA活動(dòng)狀態(tài)可能相關(guān)，Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是疾病活動(dòng)狀態(tài)的影響因素；而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值在輕度活動(dòng)期組與中度活動(dòng)期組、中度活動(dòng)期組與重度活動(dòng)期組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本研究樣本量較小，造成統(tǒng)計(jì)偏差有關(guān)。有臨床研究表明[19]，經(jīng)過(guò)IMiDs治療，患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加明顯，并使得Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比值下調(diào)，這有助于恢復(fù)患者機(jī)體免疫耐受狀態(tài)，改善療效。由此可見(jiàn)，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖，進(jìn)而改善機(jī)體免疫耐受，有可能成為RA等風(fēng)濕性疾病治療的重要靶點(diǎn)。

本研究存在局限性：首先，樣本量較小，統(tǒng)計(jì)分析難免存在偏倚，因此后續(xù)仍有待擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)觀察CD4+T細(xì)胞亞群在RA患者中的表達(dá)變化，進(jìn)一步明確CD4+T細(xì)胞亞群在RA發(fā)病中的作用，為臨床診治提供指導(dǎo)；其次，RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多種因素有關(guān)，即便是免疫系統(tǒng)方面也存在其他多種T細(xì)胞如CD8+CD25+T細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞等，這在本研究中未涉及到，有待未來(lái)進(jìn)一步研究觀察。

綜上，RA患者存在CD4+T細(xì)胞亞群失衡，主要特征表現(xiàn)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，并且與疾病活動(dòng)度存在相關(guān)性，可能參與了RA的發(fā)病過(guò)程，同時(shí)這有望為RA的治療提供新的思路。