劉昊靈，吳玉丹，李貝貝，趙 玥，王 怡，桂憶南

(聯(lián)勤保障部隊第九八七醫(yī)院 病理科，陜西 寶雞721004)

代謝失調(diào)是腫瘤發(fā)生的一個重要步驟，而谷氨酰胺分解被證明是一種必不可少的代謝途徑。腫瘤細(xì)胞通過代謝重編程，進而最有效地為自身增殖和生存提供所需的能量，這就使得它們高度依賴于谷氨酰胺的代謝過程[1]。乳腺癌屬于高度異質(zhì)性腫瘤，不同分子亞型的代謝失調(diào)水平可能存在很大的差異，因此，觀察不同分子亞型乳腺癌的腫瘤代謝特征差異可以進一步指導(dǎo)或預(yù)測治療結(jié)局，并為治療方法提供新的靶點[2]。谷氨酸脫氫酶(GLUD)是谷氨酰胺分解過程中的關(guān)鍵酶，包括2種同工酶，即GLUD1和GLUD2，其中GLUD1不僅是維持三羧酸循環(huán)(TAC)的關(guān)鍵酶，而且還在雷帕霉素復(fù)合物靶蛋白1(mTORC1)的激活和氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[3]。本研究旨在確定乳腺癌組織中GLUD1 mRNA和蛋白在不同分子亞型中的生物學(xué)和臨床特征相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年3月—2017年10月期間在聯(lián)勤保障部隊第九八七醫(yī)院接受乳腺癌手術(shù)的145例患者臨床資料進行回顧性分析，入選患者年齡19.0-87.0歲，平均年齡為(51.34±15.44)歲。所有患者均根據(jù)世界衛(wèi)生組織2012年病理診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]確診為原發(fā)型單側(cè)乳腺癌且病例臨床資料完整，入院前未接受過任何治療。排除以下條件的患者：(1)男性乳腺癌患者；(2)妊娠或哺乳期患者；(3)合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤者。術(shù)中收集的新鮮組織標(biāo)本即刻置于液氮中凍存24 h，隨后保存在-70℃直至分析。另外部分組織用4%甲醛溶液固定，制備石蠟包埋蠟塊，用作病理組織檢查或免疫組織化學(xué)(IHC)染色。醫(yī)療記錄和病理報告用來檢索關(guān)于腫瘤直徑、位置、腋窩淋巴結(jié)受累等信息，并進行全面的病理學(xué)評估，包括侵襲性、組織類型、分級、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)、人表皮生長因子受體2(HER2)、Ki67表達狀態(tài)等。ER和PR核染色率>10%則視為陽性。HER2陽性結(jié)果定義為HER2/CEP17熒光原位雜交比≥2.0和(或)IHC得分3+。根據(jù)2013年St.Gallen會議[5]通過的標(biāo)準(zhǔn)進行分型，根據(jù)ER、PR、HER2狀態(tài)和Ki-67陽性率，乳腺癌患者分為4種分子亞型：Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達型、三陰性。本研究經(jīng)由本院機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)，符合赫爾辛基宣言。所有參與者均簽署書面的知情同意書。

1.2 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

使用R 2.15.3軟件，利用Epicalc函數(shù)包從美國公共癌癥基因數(shù)據(jù)庫(TCGA)下載并處理乳腺癌基因組和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，對1 085例乳腺癌樣本中的GLUD1基因表達進行評估，并且進一步分析了GLUD1基因與ER、PR、HER2受體表達狀態(tài)的關(guān)系。

1.3 實時熒光定量PCR(QPCR)法檢測組織GLUD1 mRNA表達

將-80℃環(huán)境中的乳腺癌組織及癌旁組織樣本根據(jù)制造商說明，使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)提取組織總RNA，通過納米滴吸收光度法檢測以確定RNA質(zhì)量，后續(xù)反應(yīng)僅使用A260/280>2.0的RNA片段。經(jīng)miScript Ⅱ RT試劑盒(Qiagen公司，德國)逆轉(zhuǎn)錄后，使用ABI-prism 7700系統(tǒng)(PE Applied Biosystems,美國)進行RT-qPCR反應(yīng)，所有樣品50℃孵育2 min，95℃孵育10 min，擴增條件為95℃15 s，60℃退火延伸60 s，共40個循環(huán)。之后使用Sequence DetectorTM軟件(PE Applied Biosystems,美國)根據(jù)閾值周期數(shù)(threshold cycle number，CT)檢測熒光信號，以2-ΔΔCT法計算結(jié)果。線蟲miR-39作為組織表達的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化控制，所有反應(yīng)均平行進行三次。GLUD1 mRNA引物序列：上游引物5’-GGG GTA GAG CTG CTT CAC TTT-3’，下游引物5’-AGC CCC GAG GTT GTT GTT TT-3’。

1.4 IHC染色法檢測組織GLUD1蛋白表達

用福爾馬林固定BC組織及鄰近正常組織，石蠟包埋。切片用二甲苯脫蠟，不同濃度的乙醇和ddH2O進行再水化。然后用3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，并將切片與GUD1一級抗體在4 ℃孵育過夜。在室溫下加入二級抗體培養(yǎng)1 h，用鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物檢測組織標(biāo)本。每例標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下隨機觀察5個視野的著色情況。使用修正的組織化學(xué)評分法(H-score)對IHC染色結(jié)果進行判斷，在染色強度方面，采用0、1、2、3分別對應(yīng)于陰性、弱、中、強染色，并主觀估計各分值的百分比，另外陽性染色比計分為：0分為無陽性腫瘤細(xì)胞；1分為<10%，2分為11%-30%，3分為31%-70%，4分為70%以上。最終計算強度和百分比得分的乘積，免疫反應(yīng)評分(IRS)是兩個參數(shù)的乘積。使用這種評估方法，通過測定IRS來評估GDH表達，評分為0、1、2、3、4、6、8、9或12。樣本分為以下兩組：低(IRS)組為0-4分，高(IRS)組為≥6分(免疫反應(yīng)評分為0、1、2、3、4、6、8、9或12分，≥6分為高表達，1-4分為低表達，0分為陰性表達)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘GLUD1在乳腺癌組織中的表達情況乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達量顯著低于正常乳腺組織中的表達量(P<0.05)；在1 085例乳腺癌組織中，14例(1.29%)表現(xiàn)為復(fù)制數(shù)增加，但是有32例(2.95%)表現(xiàn)為復(fù)制數(shù)減少。另外，756例ER+組乳腺癌組織中，GLUD1 mRNA表達量顯著高于228例ER-組組織中的表達量(P<0.05)；656例PR+組乳腺癌組織中，GLUD1 mRNA表達量顯著高于325例PR-組組織中的表達量(P<0.05)，見圖1。

圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析GLUD1 mRNA在乳腺癌組織中的表達情況

2.2 乳腺癌患者不同組織中GLUD1 mRNA以及GLUD1蛋白表達比較經(jīng)QPCR法檢測，乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達量顯著低于癌旁乳腺組織(1.00±0.17 vs.0.63±0.27，P<0.05)。同時經(jīng)IHC染色法檢測，GLUD1蛋白主要表達于腫瘤細(xì)胞的胞漿中，腫瘤組織中GLUD1蛋白高表達率顯著低于癌旁乳腺組織[28.28%(41/145)vs.53.79%(78/145)，P<0.05，圖2]。另外GLUD1蛋白陽性表達組織中GLUD1 mRNA表達量高于陰性表達組織(P<0.05)，經(jīng)Pearson法分析，GLUD1蛋白表達與GLUD1 mRNA表達量呈顯著正相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為0.735，P<0.001)。

圖2 乳腺癌組織中GLUD1蛋白的表達

2.3 乳腺癌患者組織GLUD1蛋白表達與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系經(jīng)單因素分析，乳腺癌組織GLUD1蛋白表達與臨床T分期、N分期、腫瘤分級、ER和PR表達狀態(tài)有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺癌患者組織GLUD1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 不同分子分型患者組織GLUD1 mRNA和GLUD1蛋白表達比較比較不同分子亞型中GLUD1 mRNA和GLUD1蛋白表達水平時，發(fā)現(xiàn)在Luminal A型及Luminal B型中GLUD1 mRNA和蛋白表達較其他分子分型高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同分子分型患者組織GLUD1 mRNA和GLUD1蛋白表達分析

3 討論

目前臨床對乳腺癌異質(zhì)性的研究逐漸深入，異質(zhì)性與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、腫瘤微環(huán)境均密切相關(guān)，谷氨酰胺分解被證明是維持細(xì)胞增殖和存活的一種必需代謝途徑[6]。在乳腺癌中，不同分子亞型之間存在一定的代謝差異性，本研究發(fā)現(xiàn)GLUD1在mRNA和蛋白水平上表達量均下調(diào)，尤其是在高分級(Ⅲ級)和三陰性或HER2過表達型乳腺癌的腫瘤組織中。

根據(jù)最新報告的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2019年新增乳腺癌病例約占全部癌癥病例的30%左右，根據(jù)受體(ER、PR、HER2)表達狀態(tài)，高達70% 的乳腺癌被歸類為ER陽性，這意味著雌激素在乳腺癌的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[7]。因此，ER信號傳導(dǎo)通路成為大多數(shù)乳腺癌患者開發(fā)新療法的潛在靶點。例如Wang等學(xué)者[8]通過整合TCGA和Metabric公共數(shù)據(jù)庫中的信息確定了部分與ER+相關(guān)的氨基酸代謝限速酶，證實ER+乳腺癌的預(yù)后與氨基酸代謝的限速基因及其下游網(wǎng)絡(luò)之間存在密切聯(lián)系，例如氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的活性增加、?；撬岷痛闻；撬?、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝途徑失調(diào)等。因此氨基酸代謝譜的差異能夠區(qū)分ER+和ER-性乳腺癌。關(guān)于GLUD1對谷氨酰胺代謝潛在影響的研究仍然有限。因此，本研究首先基于TCGA數(shù)據(jù)庫信息，利用大量乳腺腫瘤的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平研究了GLUD1，以便更好地了解GLUD1在乳腺癌及其分子亞型中的潛在作用。結(jié)果顯示乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達量顯著低于正常乳腺組織；在1085例乳腺癌組織中，14例(1.29%)表現(xiàn)為復(fù)制數(shù)增加，但是有32例(2.95%)表現(xiàn)為復(fù)制數(shù)減少。另外，ER+組乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達量顯著高于ER-組組織中的表達量，同樣PR+組乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達量顯著高于PR-組組織中的表達量(P<0.05)，本研究結(jié)果與其基本一致。本研究中發(fā)現(xiàn)在Luminal A型及Luminal B型中GLUD1 mRNA和GLUD1蛋白表達量較其他分子分型較高，說明檢測GLUD1表達可以有助于區(qū)分不同分子亞型的乳腺癌組織，但本研究中并未追蹤患者的治療效果，不能證明GLUD1表達是否與患者預(yù)后或治療反應(yīng)有關(guān)，這也是本研究的局限性之一。

腫瘤細(xì)胞具有無限分裂和持續(xù)生長的潛力。這個過程依賴于從饑餓和缺氧的微環(huán)境中獲取必需的營養(yǎng)成分。腫瘤細(xì)胞的代謝修正能力取決于它們在腫瘤微環(huán)境中通過細(xì)胞內(nèi)基因表達和細(xì)胞間相互作用改變合成和分解代謝途徑的能力。氨基酸是蛋白質(zhì)合成能量和代謝物的來源，氨基酸降解酶的過度表達已經(jīng)在許多癌癥中被檢測到[9]。例如Spinelli等學(xué)者[10]認(rèn)為GLUD催化的氨同化作用會刺激乳腺癌細(xì)胞的增殖與生長，同時癌細(xì)胞主要通過GLUD催化的還原胺化作用吸收氨，其次反應(yīng)可以使其他氨基酸直接獲取氮，為乳腺癌新陳代謝提供氮源。降解的氨基酸為細(xì)胞能量和合成代謝過程提供代謝產(chǎn)物，也是癌細(xì)胞免疫逃避的調(diào)節(jié)劑。在腫瘤微環(huán)境中，吲哚胺-2,3-雙加氧酶和精氨酸酶的高表達分別導(dǎo)致色氨酸和精氨酸的缺失。降低色氨酸和精氨酸水平抑制腫瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞增殖[11]。乳腺癌細(xì)胞通過使用氨基酸降解酶作為免疫抑制因子來提高其生存能力。其中一些氨基酸相關(guān)基因編碼與代謝病相關(guān)的限速酶。在本研究中，乳腺癌組織中GLUD1 mRNA表達量與GLUD1蛋白表達量呈正相關(guān)性，說明GLUD1蛋白的表達受到GLUD1 mRNA的調(diào)控。而GLUD1在蛋白水平上參與乳腺癌細(xì)胞的惡性化進展并不令人驚訝。GLUD1是谷氨酰胺分解第二脫氨基階段的關(guān)鍵酶，它被亮氨酸激活，使谷氨酸脫氨到α-酮戊二酸，然后并入TCA循環(huán)，這是增殖細(xì)胞中的一個關(guān)鍵的過程[12]。亮氨酸可激活mTORC1，該蛋白在腫瘤細(xì)胞中具有多種功能，包括調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化、防止細(xì)胞凋亡和腫瘤細(xì)胞增殖[13]。一些研究也已經(jīng)證實了谷氨酰胺分解在mTOR信號通路中的重要性，當(dāng)mTORC1被過度激活時，它被認(rèn)為在促進癌細(xì)胞生長和增殖方面有重要作用。mTORC1是兩種多蛋白復(fù)合物之一，受多種上行信號調(diào)節(jié)，包括生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸和葡萄糖。亮氨酸被認(rèn)為是mTORC1的關(guān)鍵激活因子，它通過刺激 RagA/B復(fù)合體的GTP狀態(tài)，進而將mTORC1吸收到蛋白質(zhì)中，在蛋白質(zhì)中被溶酶體結(jié)合蛋白Rheb激活[14]。谷氨酰胺也被認(rèn)為是mTORC1信號傳導(dǎo)的重要氨基酸，因為它可以通過增加亮氨酸的攝取間接刺激這一途徑。例如Duran等[15]證明，谷氨酰胺與亮氨酸結(jié)合，增加了Ragb基因表達，促進了GLUD1的激活，增強了谷氨酰胺分解和α-酮戊二酸的合成。由于亮氨酸直接結(jié)合并調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，因此GLUD1可能是通過調(diào)節(jié)mTORC1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響腫瘤細(xì)胞的增殖，因此據(jù)上述實驗結(jié)論推斷，GLUD1有望成為乳腺癌治療的新靶點。但是GLUD1影響腫瘤細(xì)胞生存的作用機制尚不明確，這就需要在將來的研究工作中對其進行更深入的分析，從而為臨床轉(zhuǎn)化提供更可靠的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，乳腺癌患者腫瘤組織中GLUD1 mRNA表達量及GLUD1蛋白高表達率均較癌旁組織普遍降低，尤其是多見于惡性化程度更高或ER-/PR-乳腺癌組織中，這有望成為指導(dǎo)乳腺癌個性化治療的新靶點。