李 霞，黃東萍，趙苗苗，李崇勇，何 潔，王仕寶，崔艷麗

（1.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林技術(shù)與生物工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.漢中食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西 漢中 723000；3.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 漢中 723000；4.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 秦巴山區(qū)藥（食）用植物研究所，陜西 漢中 723000；5.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 基礎(chǔ)課教學(xué)部，陜西 漢中 723000）

紅茴香（Illicium henryi Diels）又名紅毒茴，系木蘭科八角屬植物，為中國(guó)所特有，生于海拔300～2 200 m的丘陵或山地溝谷、溪邊濕潤(rùn)常綠闊葉林中或林緣[1]，主產(chǎn)于陜西、甘肅、云南、廣西等地。第4次全國(guó)中藥資源普查陜西寧強(qiáng)縣普查隊(duì)在普查中發(fā)現(xiàn)，紅茴香在寧強(qiáng)縣等陜南區(qū)域分布廣泛，在民間經(jīng)常替代八角茴香作為調(diào)味品食用。

莽草酸（Shikimic acid），又名毒八角酸，是可有效應(yīng)對(duì)禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒藥物-達(dá)菲的重要原料[2]。另外，還可作為抗病毒和抗癌藥物中間體[3]。莽草酸（SA）在生物活性方面具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，其主要通過(guò)影響花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集、動(dòng)、靜脈血栓及腦血栓形成；其次，莽草酸具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[4]。莽草酸（SA）廣泛存在于木蘭科八角屬植物的果實(shí)中，因此對(duì)果實(shí)中莽草酸（SA）的提取分離、含量檢測(cè)等方面文獻(xiàn)報(bào)道較多，而對(duì)其葉子中活性成分及資源的開發(fā)利用研究相對(duì)較少。在陜南巴山區(qū)域，野生紅茴香分布較廣，但是對(duì)資源的開發(fā)利用相對(duì)單一，主要集中于果實(shí)作為調(diào)味品自采自用，對(duì)于其他部位（如葉子等）資源均廢棄未用?；谝陨锨闆r，就陜產(chǎn)紅茴香葉中的莽草酸（SA）含量進(jìn)行測(cè)定，從而為該地區(qū)大量的紅茴香資源的開發(fā)利用做好基礎(chǔ)研究工作。

1 儀器材料與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀、LC-20AT型輸液泵、SPD-M20A型二極管陣列檢測(cè)器、KQ-800E型超聲波清洗器、HL-500A型高速多功能粉碎機(jī)、MS105DU型電子天平（d=0.01 mg）等。

莽草酸（SA）對(duì)照品，北京華工科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司提供（批號(hào)AF8102671，純度98%）。試驗(yàn)材料于2020年10月采自陜西寧強(qiáng)縣大安鎮(zhèn)，經(jīng)漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院秦巴山區(qū)（食）藥用研究所王仕寶副教授鑒定為木蘭科植物紅茴香的葉，自然干燥后保存，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

色譜柱：Hedera NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-水（用磷酸調(diào)pH值3.5）（40∶60），流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；進(jìn)樣量20 μL。

紅茴香對(duì)照品與樣品色譜圖見圖1。

圖1 紅茴香對(duì)照品與樣品色譜圖

2.2 溶液制備

（1）對(duì)照品貯備液。取莽草酸（SA）對(duì)照品適量，精密稱定，至25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對(duì)照品貯備液（質(zhì)量濃度為556.25 μg/mL）。

（2）供試品溶液的制備。取干燥后的紅茴香葉粉碎，過(guò)2號(hào)篩，取0.25 g精密稱定，至100 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考查

2.3.1 提取方法考查

（1）粉碎粒度考查。供試品粉碎后分別過(guò)1號(hào)篩、2號(hào)篩、3號(hào)篩、4號(hào)篩。

不同粒度供試品中莽草酸含量的測(cè)定見圖2。

圖2 不同粒度供試品中莽草酸含量的測(cè)定

通過(guò)比較不同過(guò)篩粒度，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定粉碎粒度為過(guò)2號(hào)篩較為適宜。

（2）溶劑考查。供試品粉碎后過(guò)2號(hào)篩，分別用體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇、95%乙醇、50%甲醇、100%甲醇，以及水溶液為溶劑進(jìn)行提取。

不同提取溶劑供試品中莽草酸含量的測(cè)定見圖3。

圖3 不同提取溶劑供試品中莽草酸含量的測(cè)定

通過(guò)比較不同的提取溶劑，最后根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定樣品提取溶劑為100%甲醇較為適宜。

（3）提取時(shí)間考查。供試品粉碎后過(guò)2號(hào)篩，以甲醇為提取劑，分別超聲時(shí)間10，20，30，40 min提取。

不同提取時(shí)間供試品中莽草酸含量的測(cè)定見圖4。

圖4 不同提取時(shí)間供試品中莽草酸含量的測(cè)定

通過(guò)比較不同的提取時(shí)間，最后根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定樣品超聲提取時(shí)間為30 min較為適宜。

2.3.2 線性范圍考查

精密量取莽草酸貯備液0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL分別加入在50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。制成質(zhì)量濃度分別為5.56，11.13，22.25，55.63，111.25 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別注入液相色譜測(cè)定峰面積，以莽草酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積值為縱坐標(biāo)Y作圖，得回歸方程Y=52 669.3X-33 000.2，R=0.999 9。結(jié)果表明，莽草酸進(jìn)樣量在5.56～111.25 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

分別制備供試品5份進(jìn)行測(cè)定。

供試品重復(fù)試驗(yàn)見表1。

表1 供試品重復(fù)試驗(yàn)

RSD=1.8%，表明具有較好的重復(fù)性。

2.3.4 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液分別于0，6，12，24，48 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。RSD=0.8%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密稱取9份已知含量的供試品適量，精密加入貯備液適量，各份均依樣品溶液的制備項(xiàng)下制樣方法制備供試品溶液。

加樣回收率（n=9）見表2。

表2 加樣回收率（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，依2.3方法制備供試品溶液，在2.1色譜條件測(cè)定，記錄峰面積值，并用2.3.2回歸方程計(jì)算其含量，測(cè)定結(jié)果分別為14.64，14.75，14.69 mg/g，平均含量為14.69 mg/g。

3 結(jié)論

（1）木蘭科八角屬植物中，除栽培的八角（Illicium verum Hook f.）外，其他野生種類的果實(shí)大多有毒，甚至劇毒。因此，第一，切不可將野八角作為食用調(diào)料的八角收購(gòu)或使用；第二，對(duì)八角的種類鑒別和基原考證顯得尤為重要，特別是由于紅茴香和紅毒茴的中文名稱經(jīng)常互用，所以在民間也出現(xiàn)混淆的情況。結(jié)合文獻(xiàn)[5-6]及中國(guó)植物志[7]，發(fā)現(xiàn)紅茴香和紅毒茴是2個(gè)不同的種類，紅茴香（Illicium henryi Diels）又稱紅毒茴、披針葉茴香、莽草（古名）等；紅毒茴（Illicium lanceolatum A.C.Smith.）又稱紅茴香、披針葉茴香、莽草、窄葉紅茴香、披針葉八角等。另外，八角屬（Illicium）植物中，部分種類具有藥用價(jià)值[8]。在民間調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)紅茴香的果實(shí)、根皮及葉均為藥用，主要治療跌打損傷、瘀血腫痛、風(fēng)濕痛等痹證。關(guān)于八角屬植物中的莽草酸（SA），除了抗病毒之外，還具有抗腫瘤和對(duì)心血管系統(tǒng)的作用[9]。近期文獻(xiàn)報(bào)道，莽草酸（SA）還可作為一種有效的組織再生劑，在人類人工皮膚模型中證實(shí)能夠促進(jìn)傷口愈合和增強(qiáng)真皮重建的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)資木瓜中莽草酸（SA）通過(guò)減少RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒抑制大鼠軟骨細(xì)胞分化[10]。

（2）藥材中有效成分的提取方法多樣，該紅茴香樣品在前期試驗(yàn)中探究了回流、超聲、浸漬、微波輔助及索氏提取等方法，通過(guò)比較紅茴香葉中莽草酸（SA）提取得率，選擇了超聲提取方法較為適宜。此外，考查了單因素對(duì)提取得率的影響，最后綜合試驗(yàn)結(jié)果確定紅茴香葉過(guò)2號(hào)篩子，溶劑為100%甲醇，提取時(shí)間、次數(shù)分別為30min和2次。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，用二極管陣列檢測(cè)器在一定條件下，分析了莽草酸（SA）對(duì)照品色譜峰及樣品中目標(biāo)組分對(duì)應(yīng)色譜峰的紫外光譜，確定莽草酸（SA）在波長(zhǎng)210 nm處有最大吸收。因此，選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，根據(jù)實(shí)際液相檢測(cè)效果分析，既可對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行準(zhǔn)確分析，又可將相關(guān)物質(zhì)有效檢出，從而較為準(zhǔn)確地反映出樣品中的信息，故選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)較為適宜。結(jié)合對(duì)流動(dòng)相的優(yōu)化，確定乙腈-水（用磷酸調(diào)pH值3.5）（40∶60），色譜峰分離較好，拖尾現(xiàn)象較少，故以乙腈-水的磷酸溶液作為流動(dòng)相。此外，色譜柱：Hedera NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1 mL/min，檢測(cè)進(jìn)樣量20 μL。最后通過(guò)綜合比較，對(duì)目標(biāo)成分莽草酸（SA）檢測(cè)效果較好，測(cè)定值穩(wěn)定可靠。