吳 斌，姜 蕾，候吉超，宋晶晶，吳江超

（1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室，新疆 喀什 844000）

0 引言

沙棘即醋柳、酸刺，是一種富含維C[1]、氨基酸和胡蘿卜素[2]的胡頹子科植物（Hjppophae rhamnoides L.）的成熟果實，除了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)之外，還具有較為廣泛的藥用價值，可用于治療心臟病、心血管疾病[3]，具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀[4]、增強免疫力、抗腫瘤、抗癌[5]等功效，其食藥同源的特性也在食品和保健品開發(fā)領(lǐng)域得到廣泛重視，但沙棘汁由于存在不愉快氣味而很少被人接受，因此采取方法改善其風(fēng)味勢在必行。酒精發(fā)酵是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC）將糖轉(zhuǎn)化為酒精、高級醇和少量甘油、CO2的過程[6]，酵母菌通過自身發(fā)酵特性和代謝賦予發(fā)酵制品不同的品質(zhì)[7]和風(fēng)味[8]。目前，有研究采用釀酒酵母輕度發(fā)酵了沙棘汁，優(yōu)化了發(fā)酵工藝，以改善沙棘汁的風(fēng)味[9]，但輕度發(fā)酵對風(fēng)味成分的具體影響尚不明確。

以新鮮沙棘汁為原料，通過使用酵母菌輕度發(fā)酵沙棘汁改善其風(fēng)味，旨在通過輕度酒精發(fā)酵改善其不良?xì)馕?，探究輕度發(fā)酵對沙棘汁風(fēng)味的影響，用商業(yè)釀酒酵母輕度發(fā)酵沙棘汁，通過HS-SPMEGC-MS技術(shù)檢測沙棘汁發(fā)酵前后的揮發(fā)性香氣成分，結(jié)合聚類分析和顯著性差異分析輕度發(fā)酵對沙棘汁的主要揮發(fā)性香氣成分的影響，以期開發(fā)一款大眾接受的輕度發(fā)酵沙棘汁飲料，促進沙棘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘原汁，購自新疆維吾爾自治區(qū)喀什市，包裝完整無損壞，原汁無變質(zhì)現(xiàn)象。

AWRI-796型活性干酵母，澳大利亞Mauribrew公司提供；果膠酶、偏重亞硫酸鉀，法國Lallemand公司提供；2-辛醇，上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭，美國Supelco公司產(chǎn)品；HP-INNOWax毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm）、QP2020 NX型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司產(chǎn)品；C-MAG HS 4型磁力攪拌器，德國IKA公司產(chǎn)品；頂空固相萃取裝置，美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 輕度發(fā)酵沙棘汁

參考孫乾坤等人[9]的方法，配置3%葡萄糖的蒸餾水，煮沸冷卻至30℃后加入活性干酵母并恒溫攪拌，直至溶液中有氣體產(chǎn)出表明活化完成，調(diào)整菌濃度為1×106CFU/mL。添加白砂糖將沙棘汁的糖度調(diào)整為10 °Bx，原汁與水1∶1混合，然后向沙棘汁中加入50 mg/L SO2，隨后按照果汁質(zhì)量的0.03%添加活化好的釀酒酵母，于28℃下恒溫發(fā)酵24 h。

1.4 揮發(fā)性香氣物質(zhì)測定

1.4.1 香氣物質(zhì)的提取

樣品香氣物質(zhì)的提取主要參考余歡等人[10]的方法，取沙棘汁5 mL置于20 mL頂空瓶中，加入質(zhì)量濃度為100 μg/mL的2-辛醇2 μL作為內(nèi)標(biāo)，密封頂空瓶并于45℃下加熱10 min，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于45℃下吸附40 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250℃下解析5 min，進行GC-MS分析。

1.4.2 色譜條件

GC-MS分析主要參考PLESSAS等人[11]的方法，采用恒定流量模式，起始柱溫40℃，以5℃/min升至90℃；再以10℃/min升至230℃，保留7 min。載氣為純度99.99%的氦氣，流量0.8 mL/min，汽化室溫度230℃。

1.4.3 質(zhì)譜條件

電子電離（Electronionization，EI）離子源，電子能量70 eV，接口溫度為250℃，離子源溫度為200℃，燈絲發(fā)射電流為100 μA，檢測器電壓1 kV。

1.4.4 揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量分析

定性方法：通過比較質(zhì)譜與NIST15質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫來鑒定化合物，保留正、反匹配度均大于800（最大值為1 000）的鑒定結(jié)果。

定量方法：采用直接內(nèi)標(biāo)法定量，以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)（100 μg/mL），計算公式為：

式中：Cx——各組分香氣質(zhì)量濃度，μg/L；

C1——內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/L；

M1——待測組分的峰面積；

M2——內(nèi)標(biāo)物的峰面積；

V1——內(nèi)標(biāo)物體積，mL；

V2——樣品體積，mL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Origin Pro 2017軟件作圖、SPSS 23.0軟件進行香氣物質(zhì)組間顯著性差異分析（Duncan檢驗，p＜0.05）和歐式聚類分析，Microsoft Office 2016進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前后沙棘汁揮發(fā)性香氣物質(zhì)的組成

沙棘汁發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分總離子流圖見圖1，沙棘汁發(fā)酵前后香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度比較見圖2，沙棘汁發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣物質(zhì)見表1。

圖1 沙棘汁發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分總離子流圖

圖2 沙棘汁發(fā)酵前后香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度比較

在發(fā)酵前后的沙棘汁中共鑒定出68種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中包括29種酯、13種醇、15種酸、6種醛、2種酮、3種酚。由此可見，沙棘汁中主要揮發(fā)性物質(zhì)為酯類，其次是酸類和醇類。在發(fā)酵前，共檢測出64種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中包括29種酯、13種醇、11種酸、6種醛、2種酮、3種酚。而在發(fā)酵后的沙棘汁中，共檢測出62種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中包括23種酯、13種醇、15種酸、6種醛、2種酮、3種酚。從總體香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度來看，經(jīng)發(fā)酵后的沙棘汁酯類香氣成分質(zhì)量濃度（11 747.53 μg/L）和醇類香氣成分質(zhì)量濃度（5 416.75 μg/L）比發(fā)酵前有所提升，但也損失6種酯類化合物，而且還新增加了4種酸類化合物，包括異丁酸、苯甲酸和2-羥基肉桂酸等。

2.2 發(fā)酵對沙棘汁香氣成分的影響分析

2.2.1 酯類化合物

酯類物質(zhì)對酒類的花果香氣具有主要貢獻[12]。由圖2和表1可知，在沙棘汁樣品中共檢出29種酯類物質(zhì)，其中發(fā)酵前沙棘汁29種，發(fā)酵后沙棘汁23種，相較于發(fā)酵前沙棘汁（10 273.99 μg/L），發(fā)酵后沙棘汁（11 747.53 μg/L）酯類物質(zhì)總含量均顯著升高。主要表現(xiàn)為乙酸乙酯、己酸乙酯和苯甲酸乙酯含量的上升及物質(zhì)組成的差異，其中乙酸乙酯可賦予沙棘汁微帶果香的酒香氣味，己酸乙酯具有草莓、菠蘿香氣，苯甲酸乙酯具有依蘭和熱帶花香，增加了沙棘汁水果類香氣強度。同時，經(jīng)過發(fā)酵后的沙棘汁酯類香氣物質(zhì)種類減少了6種，分別是戊酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、肉桂酸乙酯、異戊酸異戊酯、己酸丙酯和2-糠酸乙酯，降低了沙棘汁的香氣多樣性，減少的酯類香氣物質(zhì)總質(zhì)量濃度為27.69 mg/L，對總體香氣強度的影響較小。

表1 沙棘汁發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣物質(zhì)

（接表1）

2.2.2 醇類化合物

釀酒酵母在酒精發(fā)酵過程中通過自身代謝生成酒精的同時會產(chǎn)生甘油和高級醇等副產(chǎn)物[13]，其中高級醇對酒類的風(fēng)味具有重要作用，當(dāng)質(zhì)量濃度大于400 mg/L時，會有強烈的刺鼻味，而當(dāng)質(zhì)量濃度小于300 mg/L時，可以使香氣更具復(fù)雜性[12]。由圖2和表1可知，在沙棘汁樣品中共檢出13種醇類物質(zhì)，總質(zhì)量濃度均小于300 mg/L，相較于發(fā)酵前的沙棘汁，輕度發(fā)酵后的沙棘汁的高級醇含量均顯著增加，主要表現(xiàn)在乙醇、異戊醇和苯乙醇含量的增加。其中，異戊醇含量質(zhì)量濃度從102.13 μg/L上升至198.55 μg/L，乙醇質(zhì)量濃度從804.35 μg/L上升至1 589.75 μg/L，苯乙醇質(zhì)量濃度從1 107.75 μg/L上升至1 570.47 μg/L，分別上升94.4%，97.6%，41.8%。其中，乙醇賦予了沙棘汁發(fā)酵酒香，適量的異戊醇可以增加沙棘汁的醇厚感。苯乙醇可以賦予沙棘汁玫瑰和蜂蜜氣味，同時也是威代爾冰酒的特征香氣[14]。

2.2.3 酸類化合物

沙棘汁中的酸類物質(zhì)主要來源于沙棘果實和酒精發(fā)酵代謝，其中脂肪酸是主要的酸類物質(zhì)，當(dāng)脂肪酸氣味活度值小于1時，可以加強風(fēng)味復(fù)雜性[15]。由圖2和表1可知，在沙棘汁中共檢測出15種酸類物質(zhì)，其中發(fā)酵前沙棘汁11種，發(fā)酵后沙棘汁15種，從酸類物質(zhì)總質(zhì)量濃度角度來看，發(fā)酵前和發(fā)酵后沙棘汁差異不顯著，但輕度發(fā)酵也具有一定的降酸作用。但相較于發(fā)酵前沙棘汁，發(fā)酵后沙棘汁酸類化合物增加了4種酸類化合物，分別是異丁酸、反式-己二烯二酸、2-羥基肉桂酸和苯甲酸，多樣的酸類物質(zhì)有利于沙棘汁口感的平衡。但經(jīng)過輕度發(fā)酵后的沙棘汁，辛酸質(zhì)量濃度顯著上升，從發(fā)酵前的140.83 μg/L上升至219.77 μg/L，上升56.1%，會給酒類帶來酸敗的味道，對酒類風(fēng)味具有一定負(fù)面的影響。

2.2.4 醛類化合物

醛類物質(zhì)主要來源于酒精發(fā)酵過程氨基酸在酶的作用下產(chǎn)生的醛。由圖2和表1可知，在沙棘汁樣品中共檢出6種醛類物質(zhì)，相較于發(fā)酵前沙棘汁（179.43 μg/L），發(fā)酵后的沙棘汁（51.50 μg/L）中的醛類物質(zhì)質(zhì)量濃度顯著降低，主要表現(xiàn)在2,4-二甲基苯甲醛、壬醛和呋喃甲醛質(zhì)量濃度的降低，其中2,4-二甲基苯甲醛具有苦杏仁味，壬醛具有脂肪和牛奶氣味，呋喃甲醛具有杏仁氣味，降低了沙棘汁的氣味強度，但同時醛類物質(zhì)含量的降低也增加了發(fā)酵沙棘汁的安全性，更有益于人體健康。

2.2.5 酮和酚類化合物

由圖2和表1可知，在沙棘汁樣品中，共檢出3種酚類和2種酮類，從發(fā)酵前后兩類香氣物質(zhì)含量和種類上來看，輕度發(fā)酵對沙棘汁的酮和酚類影響不大，總質(zhì)量濃度從發(fā)酵前的76.26 μg/L上升至發(fā)酵后的77.47 μg/L，僅上升1.6%，因此輕度發(fā)酵對改善沙棘汁醛類風(fēng)味物質(zhì)貢獻較小。

2.3 沙棘汁發(fā)酵前后香氣物質(zhì)聚類分析

沙棘汁發(fā)酵前后香氣物質(zhì)聚類分析樹狀圖見圖3。

采用聚類分析評估發(fā)酵前和發(fā)酵后沙棘汁中揮發(fā)性化合物的變化。通過SPSS 16.0分析軟件，以類間平均距離法作為測量方法，以歐式距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)，將發(fā)酵沙棘汁和未發(fā)酵沙棘汁樣品風(fēng)味物質(zhì)聚類成樹狀圖。由圖3可知，發(fā)酵沙棘汁和未發(fā)酵沙棘汁樣品分別被準(zhǔn)確聚為一類：一種聚類對應(yīng)于發(fā)酵前的沙棘汁樣品（before）；另一種聚類對應(yīng)于發(fā)酵后的沙棘汁樣品（after）。當(dāng)歐式距離增大至25.0時，發(fā)酵樣品和未發(fā)酵樣品才被聚為一類，說明發(fā)酵樣品和未發(fā)酵樣品之間相似度極低。表明發(fā)酵前和發(fā)酵后的整體揮發(fā)性風(fēng)味輪廓不同，經(jīng)酵母菌發(fā)酵后的沙棘汁風(fēng)味改變顯著。

3 結(jié)論

通過對輕度發(fā)酵前后沙棘汁的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行檢測分析，共檢出68種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，其中包括29種酯、13種醇、15種酸、6種醛、2種酮、3種酚。與發(fā)酵前沙棘汁相比，經(jīng)過輕度發(fā)酵能夠顯著增加沙棘汁酯類香氣物質(zhì)，主要是乙酸乙酯、己酸乙酯和苯甲酸乙酯，增強沙棘汁花果類香氣；輕度發(fā)酵后的醇類物質(zhì)含量也高于發(fā)酵前沙棘汁，表現(xiàn)為苯乙醇、異戊醇和乙醇等高級醇含量的上升，賦予沙棘汁厚重的口感和玫瑰類香氣。同時，經(jīng)過發(fā)酵新產(chǎn)生了4種酸類物質(zhì)，有利于平衡沙棘汁的口感，降低了醛類物質(zhì)的含量，提高了沙棘汁的安全性。因此，研究認(rèn)為輕度發(fā)酵能夠顯著改善沙棘汁的風(fēng)味和口感，后續(xù)工作可對輕度發(fā)酵沙棘汁工藝進行更深層次的優(yōu)化，開發(fā)一款受大眾接受和喜愛的輕度發(fā)酵沙棘汁飲料。