張巧玲，陳 浩，2，李冰鑫，林碧蓮，2，周曉潔，2，趙良忠，2

（1.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000）

酸漿豆腐因其豆香濃郁、質(zhì)地細膩、適合各種烹飪手段等優(yōu)點，深受大眾追捧和喜愛。有別于石膏豆腐或鹽鹵豆腐，酸漿豆腐是以其生產(chǎn)副產(chǎn)物——黃漿水經(jīng)自然發(fā)酵或純種發(fā)酵制得的酸漿作為凝固劑，不僅賦予了產(chǎn)品特有的氣味和滋味，而且減少了副產(chǎn)物的排放[1]。近年來，隨著消費者越來越注重食品的營養(yǎng)和風味，如何賦予這一傳統(tǒng)食品更多的保健功能、更誘人的風味，成為酸漿豆腐產(chǎn)品創(chuàng)新的目標之一。研究人員嘗試將山楂、西紅柿、沙棘、酸棗等含天然酸性成分的功能食品替換傳統(tǒng)酸漿凝固劑，制備出具有保健價值的豆腐[2-3]。但是，這些豆腐新產(chǎn)品相比于傳統(tǒng)酸漿豆腐，質(zhì)地較為松散、彈性欠佳、口感不夠細膩，甚至有少量的澀味，不利于后續(xù)的烹飪或加工。迄今未見有將功能食品和黃漿水混合發(fā)酵制備凝固劑的相關(guān)研究。

竹蓀（Dictyophora）是一種珍貴的可食用腐生真菌，被稱為“菌中王后”。竹蓀富含8種人體必需氨基酸，以及維E、煙酸、甘露聚糖和木聚糖等生物活性物質(zhì)[4]。已有研究表明，竹蓀具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗酪氨酸酶、抗炎和抗氧化等保健作用[5-7]。竹蓀子實體通常分為菌蓋、菌柄、菌裙和菌托等部位，其中菌托占鮮重的一半以上，在采摘和加工中卻被大量丟棄。然而，梁亞麗等人[8]研究表明，菌托與其他部分一樣，營養(yǎng)成分較全面，是一種尚未得到有效利用的資源。目前，通過益生菌發(fā)酵制備具有功能特性的酵素是利用果蔬副產(chǎn)物的常用方法之一。楊培青等人[9]以藍莓加工下腳料為原料，優(yōu)化發(fā)酵工藝，得到了香氣清爽、酸味純正的藍酶果渣酵素。包怡紅等人[10]則以藍靛果與米糠進行復合發(fā)酵獲得了以草酸、抗壞血酸和檸檬酸為主的酵素。邵洋洋等人[11]以廢棄菇柄為原料，以植物乳桿菌進行液體發(fā)酵獲得具有抗氧化活力的呈酸性酵素。由此可見，酵素不僅具有多種功能性成分，還含有有機酸，有替代傳統(tǒng)酸漿作為豆腐凝固劑的潛力。

以竹蓀菌托和黃漿水為原料，選用植物乳桿菌和酵母菌進行發(fā)酵，通過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，研制出一種能替代傳統(tǒng)酸漿的新型豆腐凝固劑，并以其為凝固劑生產(chǎn)了竹蓀酸漿豆腐。不僅可以解決竹蓀菌托和黃漿水的廢物利用問題，還拓寬了酵素應(yīng)用范圍，提升了豆腐的營養(yǎng)價值，符合當代消費者對綠色、營養(yǎng)食品的追求，為豆腐新產(chǎn)品開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，邵陽市糧庫提供；竹蓀，貴陽恒昌生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司提供；植物乳桿菌，無錫拜弗德生物科技有限公司提供；酵母菌，湖北安琪酵母股份有限公司提供；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，北京奧博星生物科技有限責任公司提供；纖維素酶，寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司提供；木瓜蛋白酶、果膠酶，上海源葉生物科技有限公司提供；酸漿豆腐、黃漿水，豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

J-1型熟漿豆腐生產(chǎn)設(shè)備，北京康得利智能科技有限公司產(chǎn)品；GI54DWS型立式滅菌鍋，致微（廈門）儀器有限公司產(chǎn)品；HPX-9272 MBE型恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；SW-CJ-ID型單人超凈工作臺，蘇州智凈凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；EM502C型電子溫度計，漳州市東方智能儀表有限公司產(chǎn)品；SY-1210型恒溫水浴鍋，金壇市中大儀器廠產(chǎn)品；卡路里分析儀，北京盈盛恒泰科技有限責任公司產(chǎn)品；EL20型pH計、MJ33型水分自動測定儀，梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；VELOCITY 18R型高速冷凍離心機，澳大利亞Dynamica公司產(chǎn)品；CR-400型色差計，常州三豐儀器科技有限公司產(chǎn)品；LS型質(zhì)構(gòu)儀，阿美特克有限公司產(chǎn)品；UV-1780型紫外可見分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

①菌種→活化→接種；

②竹蓀→前處理→酶解→滅菌；

③新鮮黃漿水→滅菌；

①+②+③→發(fā)酵→竹蓀酸漿→制作豆腐。

1.3.2 操作要點

（1）竹蓀的前處理。用新鮮竹蓀菌托等副產(chǎn)物置于清水中洗凈、晾干，放入粉碎機中粉碎至60目，即得到竹蓀粉末。

（2）竹蓀的酶解。參考鞏貴麗[12]的方法，進行微調(diào)：分別將果膠酶、纖維素酶和木瓜蛋白酶按比例1.5%，2.0%，2.0%（W/V）加至30 mL蒸餾水中，接著加入1 g竹蓀粉，于50℃水浴中磁力攪拌2 h，于85℃下滅酶15 min，即得到竹蓀酶解液。

（3）菌種的活化。參考陳斌等人[13]的方法，稍作調(diào)整：將適量植物乳桿菌菌粉懸浮于10 mL無菌MRS液體培養(yǎng)基，并于37℃下培養(yǎng)12 h，經(jīng)2次傳代后，作為種子液備用。

參考楊培青等人[9]的方法，稍作調(diào)整：將酵母菌菌粉溶于10 mL無菌YPD液體培養(yǎng)基懸浮，于30℃下中培養(yǎng)24 h，經(jīng)2次傳代后，作為種子液備用。

（4）竹蓀酶解液和黃漿水的滅菌。分別將竹蓀酶解液和過濾除雜的新鮮黃漿水于121℃下滅菌15 min。

（5）接種和發(fā)酵。將已滅菌的竹蓀酶解液和黃漿水按1∶4（V∶V）混合，采用碳酸鈣調(diào)節(jié)發(fā)酵初始pH值至6.0。將植物乳桿菌和酵母菌種子液培養(yǎng)至對數(shù)期，按比例為1∶1進行接種，接種量為4%，于37℃下發(fā)酵48 h，過濾除雜，即得到竹蓀酸漿。

1.3.3 單因素試驗

以菌種接種量（2%，4%，6%，8%，10%）、發(fā)酵初始pH值（4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）、發(fā)酵溫度（29，33，37，41，45℃）、發(fā)酵時間（24，36，48，60，72 h）為因素，考查上述因素對竹蓀酸漿總酸含量的影響。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取菌種接種量（A），發(fā)酵初始pH值（B），發(fā)酵溫度（C），發(fā)酵時間（D）等4個因素設(shè)計L9（34）正交試驗，以總酸含量為評價指標，優(yōu)化竹蓀酸漿發(fā)酵工藝。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

1.3.5 總酸的測定

參照呂博等人[14]的方法測定總酸。

1.3.6 OD值的測定

菌體數(shù)量以樣品于波長600 nm處的吸收值（OD值）表示。

1.3.7 總酚的測定

參照Wang L等人[15]的Folin Ciocaulten方法測定。

1.3.8 豆腐的制備

按照思旭平等人[2]方法制作豆腐，點漿改用試驗的竹蓀酸漿為豆腐凝固劑。

1.3.9 豆腐品質(zhì)的評價

（1）水分含量的測定。豆腐的水分含量使用快速水分測定儀進行測定。

（2）營養(yǎng)成分的測定。取100 g豆腐搗碎，使用卡路里分析儀測定蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等主要營養(yǎng)成分。

（3）質(zhì)構(gòu)的測定。選用TPA模式分別測定樣品的硬度、彈性、咀嚼性等指標。設(shè)置參數(shù)為探頭型號P35，測試前速度40 mm/s，測試中速度40 mm/s，測試后速度40 mm/s，下壓距離40%，觸發(fā)力0.05 N。要求樣品大小一致，一個樣品取5個不同部位。

（4）色澤的測定。將色差計用白板校準后，鏡頭對準豆腐表面測定色差值L*值、a*值和b*值。

（5）感官評價。感官評定小組由10名且經(jīng)過感官評價訓練的食品專業(yè)學生組成，分別對風味（30分）、色澤（20分）、口感（30分）及組織形態(tài)（20分）進行感官評分。

感官評價標準見表2。

表2 感官評價標準

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3次，結(jié)果以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進行顯著性分析，圖形采用Origin 2018進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對竹蓀酸漿總酸的影響

接種量對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響見圖1。

由圖1可知，接種量為2%～8%時，發(fā)酵液中總酸含量呈顯著升高的趨勢（p＜0.05），接種量8%時達到最大值4.54 g/L；而接種量為8%～10%時，發(fā)酵液中總酸含量變化不大（p＞0.05），這與陳斌等人[13]采用植物乳桿菌發(fā)酵豆干黃漿水的趨勢基本相同。此外，發(fā)酵液中OD值先顯著升高而后趨于平緩，表明接種量從2%增至4%，發(fā)酵液中活菌數(shù)激增；但接種量超過4%，活菌數(shù)增長趨緩；這可能是植物乳桿菌和酵母菌的生長繁殖受到培養(yǎng)環(huán)境中多糖等物質(zhì)消耗、pH值降低等因素的影響[14]。由圖1可知，總酸量與菌體數(shù)量呈正相關(guān)，但是不存在顯著關(guān)系。因此，綜合考慮后確定最適接種量為8%。

圖1 接種量對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響

2.2 發(fā)酵初始pH值對竹蓀酸漿總酸的影響

發(fā)酵初始pH值對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響見圖2。

由圖2可知，發(fā)酵初始pH值為4.5～5.5時，發(fā)酵液中總酸含量和OD值均先顯著升高（p＜0.05）；初始pH值在5.5～6.0，總酸含量出現(xiàn)降低，OD值卻有所增加，但是2個指標的變化均不顯著（p＞0.05）；初始pH值為6.0～6.5，總酸含量顯著降低（p＜0.05），OD值則變化不大（p＜0.05），說明植物乳桿菌和酵母菌在初始pH值為5.5～6.5時生長良好，菌數(shù)相差不大，但是初始pH值越高，產(chǎn)酸量越低。喬明武等人[16]使用乳酸菌和酵母菌以接種比例1∶4聯(lián)合發(fā)酵黃漿水，醋酸、酒石酸、丁二酸、乳酸等有機酸含量均有不同程度的提升。結(jié)合試驗結(jié)果推測，試驗所用2個菌種有機酸代謝需在一定的酸性條件下進行，但是初試pH值過低，將抑制其生長和代謝。呂博等人[14]保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌雙菌發(fā)酵過程中，黃漿水加入乳糖，初試pH值越大，發(fā)酵液色澤越深，與試驗結(jié)果相反。綜合考慮，確定最適發(fā)酵初試pH值為5.5。

圖2 發(fā)酵初始pH值對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響

2.3 發(fā)酵溫度對竹蓀酸漿總酸的影響

發(fā)酵溫度對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響

溫度是菌種生長和代謝的重要條件。由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液的總酸呈現(xiàn)先升后降的趨勢，同時OD值呈現(xiàn)前期緩慢增加后降低的現(xiàn)象。當發(fā)酵溫度在33℃時，總酸含量達到最大值4.71 g/L；而OD值在37℃時達到最大值2.431，這可能是菌種生長和產(chǎn)酸所需溫度是不一致的。不過，當溫度高于37℃，發(fā)酵液的總酸和OD值均顯著下降，說明溫度過高，不僅抑制菌種的生長繁殖，而且對有機酸的代謝和積累產(chǎn)生副作用。茍擁軍等人[17]采用植物乳桿菌對蘋果漿進行發(fā)酵，結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對菌體生長影響較大，發(fā)酵溫度在32.5℃時發(fā)酵液中活菌數(shù)最高。綜合考慮，確定最適發(fā)酵溫度為33℃。

2.4 發(fā)酵時間對竹蓀酸漿總酸的影響

發(fā)酵時間對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對竹蓀酸漿總酸含量和OD值的影響

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，前期菌數(shù)上升速度迅猛，OD值在60 h時達到最大值2.322，隨后OD值出現(xiàn)明顯降低（p＜0.05），菌數(shù)大幅降低，這可能是因為隨著時間延長，大豆異黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物逐步積累，制約菌種生長和繁殖，導致菌體數(shù)量下降。這與黨輝[18]的研究結(jié)果基本一致。發(fā)酵液中的總酸含量則呈現(xiàn)顯著升高而后趨于平緩。歐紅艷等人[19]研究表明，乳酸菌和酵母菌混菌發(fā)酵豆清飲料過程中，乳酸、檸檬酸等有機酸的生成與大豆苷、黃酮苷等大豆異黃酮的消耗有較高的相關(guān)性。另外，對山藥茯苓采用植物乳桿菌進行發(fā)酵，結(jié)果表明，相比于未發(fā)酵水提樣品，發(fā)酵液中的總多糖含量明顯更多，表明植物乳桿菌對植物原料中成分有較強的轉(zhuǎn)化能力[20]。試驗所選菌種對竹蓀多糖等成分的利用狀況有待進一步研究。綜合考慮，確定最適發(fā)酵時間為60 h。

2.5 正交試驗結(jié)果與分析

正交試驗結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果

由表3可知，各因素對竹蓀酸漿總酸含量影響的大小順序為D＞B＞A＞C，即發(fā)酵時間＞發(fā)酵初始pH值＞接種量＞發(fā)酵溫度。試驗優(yōu)化組合為A2B3C2D2，即接種量8%，發(fā)酵初始pH值6.0，發(fā)酵溫度33℃，發(fā)酵時間60 h。驗證試驗結(jié)果表明，在該工藝下竹蓀酸漿總酸含量為4.873±0.05 g/L，OD值為2.510±0.012，總酚含量為1.98±0.03 mg/mL，其色澤為淡黃色，酸味適中，無澀味，有竹蓀清香。

2.6 竹蓀酸漿豆腐與自然發(fā)酵酸漿豆腐品質(zhì)的比較

分別以竹蓀酸漿和自然發(fā)酵酸漿作為凝固劑制作豆腐，并對獲得的豆腐品質(zhì)進行評價。

竹蓀酸漿豆腐與自然發(fā)酵酸漿豆腐品質(zhì)的比較見表4。

表4 竹蓀酸漿豆腐與自然發(fā)酵酸漿豆腐品質(zhì)的比較

由表4可知，竹蓀酸漿豆腐色澤微黃，質(zhì)地細膩、有彈性，以及水分含量、蛋白質(zhì)含量等指標與自然發(fā)酵酸漿豆腐相差無幾，但是竹蓀酸漿豆腐有竹蓀清香和豆香，總酚含量更高，具有抗氧化活性，感官評分更高。因此，竹蓀酸漿豆腐既保持了傳統(tǒng)酸漿豆腐的質(zhì)構(gòu)，又增加了竹蓀風味，還具有抗氧化等保健功能的潛力。

3 結(jié)論

通過單因素試驗結(jié)合正交試驗優(yōu)化了竹蓀酸漿發(fā)酵工藝：植物乳桿菌和酵母菌的接種量為8%，發(fā)酵初始pH值6.0，發(fā)酵溫度為33℃，發(fā)酵時間為60 h。該工藝獲得的竹蓀酸漿總酸含量為4.873±0.05 g/L，OD值為2.510±0.012，總酚含量為1.98±0.03 mg/mL，有益菌數(shù)量大且具有抗氧化潛力。此外，竹蓀酸漿色澤為淡黃色，酸味適中，無澀味，帶有淡淡的竹蓀清香。以竹蓀酸漿為凝固劑制得的豆腐質(zhì)地細膩、有竹蓀清香和豆香，感官評分比自然發(fā)酵的酸漿豆腐更高，具有較好的市場前景。但是竹蓀酸漿抗氧化等保健功能需要后續(xù)進一步研究。研究為提高竹蓀和豆制品生產(chǎn)副產(chǎn)物的資源利用率、微生物發(fā)酵制備豆腐凝固劑提供了新的思路。