魏娜 侯凈 王光輝 王舒 倪青

(貴州省人民醫(yī)院乳腺外科，貴州 貴陽 550002)

乳腺癌是一種常見的惡性婦科腫瘤，是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一〔1〕。迄今為止，在分子水平上乳腺癌的發(fā)病機(jī)制仍然未知。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)包含可作為ceRNA的miRNA響應(yīng)元件，并在各種病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括乳腺癌〔2〕。研究表明，LINC00958在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，敲低其表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，阻滯細(xì)胞周期，LINC00958通過調(diào)控miR-203/周期蛋白依賴性激酶(CDK)2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生中起著致癌基因的作用〔3〕。LINC00958在口腔鱗癌、非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，能促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制細(xì)胞凋亡，而下調(diào)LINC00958可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔4，5〕。miR-597-5p在人乳頭瘤病毒(HPV)16陽性子宮頸癌組織中表達(dá)下調(diào)，可能是HPV16感染后宮頸癌發(fā)生的新標(biāo)志物〔6〕。miR-597在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔7〕。但LINC00958在乳腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，且LINC00958是否通過靶向調(diào)控miR-597-5p的表達(dá)影響乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡目前尚未可知。因此，本研究對(duì)LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)和在MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡中的作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，并分析LINC00958與miR-597-5p之間的靶向關(guān)系，旨在闡明LINC00958的功能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自中國科學(xué)院細(xì)胞研究所(中國上海)；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000試劑購自Invitrogen公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自Sigma-Aldrich公司；靶向LINC00958的siRNA(si-LINC00958)和陰性對(duì)照(si-NC)、pcDNA-LINC00958和陰性對(duì)照(pcDNA)、miR-597-5p模擬物和陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-597-5p抑制劑(anti-miR-597-5p)和陰性對(duì)照(anti-miR-NC)購自RiboBio公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購自TaKaRa公司；Transwell板購自Corning公司；放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解緩沖液、雙辛可寧酸蛋白質(zhì)分析試劑盒購自Applygen公司；TBS-Tween(TBST)購自O(shè)riGene公司；二抗購自ProteinTech公司。41對(duì)配對(duì)的乳腺癌組織與癌旁組織樣本來自貴州省人民醫(yī)院2017年10月至2018年9月接受手術(shù)切除的乳腺癌患者，所有樣品通過手術(shù)獲得，并立即將切下的標(biāo)本浸入液氮中，在-80℃下保存?zhèn)溆?。本研究中使用的組織方案通過醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或其家屬知情同意。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞在10% FBS的DMEM中，37℃，5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 轉(zhuǎn)染前，將MDA-MB-231細(xì)胞以5×105/孔接種到6孔板。根據(jù)制造商的規(guī)程，當(dāng)MDA-MB-231細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，使用Lipofectamine 2000試劑將RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染到MDA-MB-231細(xì)胞中，分為si-NC組、si-LINC00958組、miR-NC組、miR-597-5p組、pcDNA組、pcDNA-LINC00958組、si-LINC00958+anti-miR-NC組、si-LINC00958+anti-miR-597-5p組。轉(zhuǎn)染48 h，通過qRT-PCR評(píng)估siRNA或pcDNA轉(zhuǎn)染的有效性。

1.4qRT-PCR檢測(cè)LINC00958和miR-597-5p表達(dá) 通過使用TRIzol試劑從乳腺癌組織或MDA-MB-231細(xì)胞中獲得總RNA樣品。然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的指南制備cDNA。對(duì)于定量分析，將SYBR Green PCR Master Mix在Step-One Plus實(shí)時(shí)PCR。比較2-ΔΔCt方法用于計(jì)算LINC00958和miR-597-5p相對(duì)表達(dá)水平。GAPDH或U6被視為內(nèi)部對(duì)照。特異性引物序列如下：LINC00958正向引物5′-GTCTCCCTGGTTTCTCACAGTT-3′，反向5′-TCCCTGGCTACAAATAACCACA-3′；miR-597-5p正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGTGTCACTCGATGAC-3′，反向5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′；GAPDH正向引物5′-CTGGGCTACACT-GAGCACC-3′，反向5′-AAGTGGTCGTTGAG-GGCAATG-3′。

1.5MTT檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染的1×104個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞接種在96孔板中。48 h時(shí)，取100 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)加入每個(gè)孔中，再孵育4 h后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)。在490 nm的波長(zhǎng)下讀取酶標(biāo)儀OD值。

1.6Transwell檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲 對(duì)于Transwell遷移測(cè)定，將無血清DMEM(200 μl)中5×104個(gè)MDA-MB-231細(xì)胞添加到Transwell的上腔室，而下腔室(600 μl)的DMEM中添加10% FBS。在37℃培養(yǎng)24 h，用棉簽除去膜上表面的細(xì)胞，室溫下用甲醇固定，0.1%的結(jié)晶紫將下表面的MDA-MB-231細(xì)胞染色20 min。使用TE2000-S倒置光學(xué)顯微鏡從3個(gè)獨(dú)立的樣本中捕獲3個(gè)不同視野的圖像，對(duì)遷移的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行定量分析。對(duì)于Transwell侵襲測(cè)定，上腔室預(yù)先涂布40 μl基質(zhì)膠。后續(xù)操作步驟同Transwell遷移測(cè)定。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡 膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒用于確定轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。MDA-MB-231細(xì)胞在冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌2次，重懸于包含5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶溶液的100 μl結(jié)合緩沖液中。在黑暗中孵育，15 min內(nèi)上FACScan流式細(xì)胞儀確定凋亡細(xì)胞的比例。

1.8Western印跡檢測(cè)Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá) 在RIPA裂解緩沖液中裂解MDA-MB-231細(xì)胞，使用二喹啉甲酸蛋白質(zhì)分析試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量，并將每個(gè)樣品中等量的蛋白(20 μg)加載到10%十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠上，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在室溫下，用5%脫脂牛奶在TBST中封閉膜1 h，然后在4℃下與一抗(稀釋為1∶10 000)孵育過夜。第2天，將PVDF膜用TBST洗滌3次，并與適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶耦聯(lián)的免疫球蛋白(Ig)G二抗(稀釋為1∶10 000)在室溫下放置1 h。通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒觀察免疫反應(yīng)帶，Image-pro plus進(jìn)行Western印跡的光密度分析。GAPDH用作負(fù)載對(duì)照。

1.9雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)分析LINC00958與miR-597-5p的靶向關(guān)系 使用pGL3-reporter熒光素酶載體構(gòu)建包含miR-597-5p結(jié)合位點(diǎn)的pGL3-LINC00958野生型(WT)或突變型(MUT)載體，分別記為WT-LINC00958或MUT-LINC00958。之后將其分別于miR-NC或miR-597-5p共同轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定WT-LINC00958或MUT-LINC00958的熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較，乳腺癌組織中LINC00958表達(dá)水平顯著升高，miR-597-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)

2.2抑制LINC00958蛋白表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 與si-NC組比較，si-LINC00958組MDA-MB-231細(xì)胞的LINC00958、ki-67蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖均顯著降低(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 Western印跡檢測(cè)Ki-67蛋白表達(dá)

2.3抑制LINC00958表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-LINC00958組遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 抑制LINC00958表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.4抑制LINC00958表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響 與si-NC組比較，si-LINC00958組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bax表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 抑制LINC00958表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

2.5LINC00958靶向調(diào)控miR-597-5p的表達(dá) LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)出LINC00958與miR-597-5p含有互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖4。miR-597-5p組比miR-NC組顯著降低WT-LINC00958熒光素酶活性(P<0.05)，miR-597-5p組與miR-NC組MUT-LINC00958熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見表4。pcDNA-LINC00958組miR-597-5p表達(dá)水平(0.42±0.04)顯著低于pcDNA組(1.00±0.05，P<0.05)，si-LINC00958組miR-597-5p表達(dá)水平(3.07±0.28)顯著高于si-NC組(1.03±0.07，P<0.05)。

圖4 LINC00958的序列中含有與miR-597-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.6miR-597-5p過表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-597-5p組MDA-MB-231細(xì)胞的miR-597-5p表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞增殖降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，凋亡率顯著增加(P<0.05)，Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bax表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖5、表5、圖6。

圖5 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 miR-597-5p過表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

圖6 miR-597-5p過表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響(結(jié)晶紫染色，×400)及細(xì)胞凋亡流式圖

2.7干擾miR-597-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00958表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用 與si-LINC00958+anti-miR-NC組比較，si-LINC00958+anti-miR-597-5p組MDA-MB-231細(xì)胞的miR-597-5p表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞增殖顯著升高(P<0.05)，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，凋亡率顯著減少(P<0.05)，Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表6、圖7、圖8。

表6 干擾miR-597-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00958表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用

圖7 干擾miR-597-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00958表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的作用(結(jié)晶紫染色，×400)及細(xì)胞凋亡流式圖

1～2：si-LINC00958+anti-miR-NC組，si-LINC00958+anti-miR-597-5p組圖8 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

缺乏特異性的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物可能導(dǎo)致乳腺癌患者的低生存率。研究表明，lncRNA在許多生物學(xué)過程中都起重要作用，而ceRNA活性與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)〔8〕。lncRNA的頻繁失調(diào)與許多細(xì)胞過程和腫瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。從機(jī)制上講，lncRNA的異常表達(dá)通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、多個(gè)靶標(biāo)和途徑而參與癌細(xì)胞的功能紊亂和許多分子過程，從而引起腫瘤的發(fā)生〔9〕。有學(xué)者提出LINC00958是與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)的致癌lncRNA〔10，11〕。LINC00958在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其上調(diào)與腫瘤分化，晚期腫瘤分期和患者總體生存期縮短有關(guān)。在體外，LINC00958表達(dá)誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞活力和集落形成〔12〕。LINC00958在子宮頸癌組織和細(xì)胞中升高，LINC00958通過負(fù)調(diào)節(jié)miR-625-5p的表達(dá)，促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔13〕。LINC00958在鼻咽癌組織標(biāo)本和細(xì)胞系中上調(diào)，LINC00958過表達(dá)與鼻咽癌患者的腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、TNM分期和較差的總體生存率顯著相關(guān)。而LINC00958下調(diào)抑制了鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并在體外誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡〔14〕。由此可見，LINC00958在多種癌癥中起著癌基因的作用。本研究結(jié)果提示LINC00958在乳腺癌中同樣作為致癌lncRNA，在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞惡性表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

miRNA異常表達(dá)參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生，進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性，已經(jīng)成為乳腺腫瘤中基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑〔15〕。研究〔16，17〕報(bào)道m(xù)iR-597-5p在結(jié)直腸癌、胰腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，研究〔16〕顯示，miR-597-5p可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。miR-597-5p可以減弱胰腺癌細(xì)胞的活力、菌落形成、侵襲，并降低Ki67、Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)增加了胰腺癌細(xì)胞的凋亡及Bax的表達(dá)〔17〕。本研究結(jié)果表明，miR-597-5p過表達(dá)使乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力顯著降低，細(xì)胞凋亡則顯著升高，并且Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)被抑制，Bax表達(dá)被促進(jìn)，與前人研究〔17〕相吻合。

研究證實(shí)，lncRNA可以充當(dāng)ceRNA，競(jìng)爭(zhēng)性地靶向miRNA并調(diào)節(jié)miRNA的功能〔18，19〕。類似的，胰腺癌中的LINC00958可以作為ceRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-330-5p〔20〕。LINC00958可與miR-5095結(jié)合通過核糖核苷酸還的酶亞單位(RR)M2來調(diào)節(jié)宮頸癌對(duì)放射療法的細(xì)胞敏感性〔21〕。LINC00958通過靶向miR-378a-3p上調(diào)類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)1R促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔22〕。本研究結(jié)果證實(shí)LINC00958可以靶向結(jié)合miR-597-5p并調(diào)節(jié)miR-597-5p的功能。在功能上，LINC00958上調(diào)降低miR-597-5p的水平，LINC00958下調(diào)提高miR-597-5p的水平。干擾miR-597-5p表達(dá)后，抑制LINC00958表達(dá)對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用被逆轉(zhuǎn)?？梢奓INC00958通過miR-597-5p調(diào)節(jié)了乳腺癌的發(fā)展。

綜上，LINC00958在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，抑制LINC00958表達(dá)可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲，同時(shí)誘導(dǎo)凋亡，機(jī)制與靶向miR-597-5p有關(guān)。LINC00958對(duì)miR-597-5p的調(diào)控可能是乳腺癌中新的致癌調(diào)控機(jī)制。LINC00958和miR-597-5p可能成為用于預(yù)防乳腺癌患者的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的候選治療靶標(biāo)。