陳曉彤 王澤南 魏 軍 胡 穎

1(濟(jì)南大學(xué)自動(dòng)化與電氣工程學(xué)院 濟(jì)南 250024)

2(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

1 引 言

生物工程研究通過人工傳代實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；募?xì)胞生產(chǎn)[1-4]，其主要環(huán)節(jié)包括接種、培養(yǎng)、脫壁和收集細(xì)胞[5]。其中，細(xì)胞脫壁對(duì)傳代效率影響較大[6-10]。目前，貼壁細(xì)胞主要的脫壁方法是胰蛋白酶消化脫落法[11-12]，即清洗細(xì)胞后在培養(yǎng)瓶中加入胰蛋白酶浸潤細(xì)胞表面，配合移液管吹打進(jìn)行細(xì)胞脫壁。胰蛋白酶可以切斷蛋白質(zhì)中的肽鍵，降解細(xì)胞膜與培養(yǎng)皿結(jié)合處的蛋白，從而使細(xì)胞脫壁。胰蛋白酶消化法主要存在兩個(gè)問題[13-14]：胰蛋白酶會(huì)損傷與細(xì)胞活性顯著相關(guān)的細(xì)胞膜蛋白[15-16]；在自動(dòng)化工業(yè)流程中，細(xì)胞脫壁效率低下。胰蛋白酶長時(shí)間地消化會(huì)延遲細(xì)胞的第一次分裂，可能使暴露于胰蛋白酶中的細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生改變，引起與代謝生長相關(guān)的蛋白下調(diào)，與凋亡相關(guān)的蛋白上調(diào)[17]，造成細(xì)胞活性降低[18-19]。細(xì)胞傳代流程的自動(dòng)化有益于降低細(xì)胞污染的概率，提高傳代[20]效率。目前，自動(dòng)化傳代流程中均使用胰蛋白酶和移液機(jī)器人進(jìn)行細(xì)胞脫壁[21]，但該方法得到純凈細(xì)胞的步驟繁雜、耗時(shí)較長。

相關(guān)學(xué)者還研發(fā)了一些無胰蛋白酶的細(xì)胞脫壁方法。一種方法是利用細(xì)胞刮刀從細(xì)胞貼壁表面分離細(xì)胞，同時(shí)將培養(yǎng)基替換為磷酸鹽緩沖鹽水[22-23]。細(xì)胞刮刀的脫壁效率主要取決于操作者的能力，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞脫壁自動(dòng)化技術(shù)難度較大。另一種方法是利用培養(yǎng)容器表面涂層技術(shù)與溫度響應(yīng)聚合物使細(xì)胞自發(fā)脫壁[24-25]。當(dāng)溫度降低時(shí)，培養(yǎng)皿表面會(huì)迅速水合，由疏水特性變?yōu)橛H水特性，使細(xì)胞自發(fā)脫落。該方法已應(yīng)用于細(xì)胞片層[26]和組織[27-28]的生成中，但培養(yǎng)容器表面的溫度響應(yīng)聚合物昂貴，為避免細(xì)胞過早脫落，還需要技術(shù)人員熟練操作，因此，尚未應(yīng)用于自動(dòng)化細(xì)胞培養(yǎng)中。Kurashina 等[29]開發(fā)了一種更換特定培養(yǎng)基后利用可調(diào)節(jié)溫度的超聲震蕩裝置進(jìn)行細(xì)胞脫壁的方法，以培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、溫度為核心變量，配合超聲震動(dòng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞脫落。但該方法在培養(yǎng)過程中，需要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行更換，難以應(yīng)用于工業(yè)自動(dòng)化流程中。

Inui 等[30]利用聚能型超聲換能器實(shí)現(xiàn)了小范圍的細(xì)胞脫落，并確定了在小區(qū)域內(nèi)穩(wěn)定消除細(xì)胞的最佳條件，但因脫落面積較小，尚未應(yīng)用于自動(dòng)化脫落中。直接利用工業(yè)超聲換能器也能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的脫壁，若可以將脫落面積擴(kuò)大，那么既可以避免對(duì)細(xì)胞蛋白造成損傷，又因其普適性可以應(yīng)用于工業(yè)自動(dòng)化生產(chǎn)中。Tauchi 等[31]曾利用工業(yè)換能器進(jìn)行細(xì)胞脫壁實(shí)驗(yàn)，并提出一種利用換能器激發(fā)超聲波和低濃度胰蛋白酶消化協(xié)同分離細(xì)胞的方法，該方法與標(biāo)準(zhǔn)濃度胰蛋白酶消化脫壁法分離的細(xì)胞數(shù)量相同，且在培養(yǎng) 72 h 后，細(xì)胞增殖的數(shù)量比標(biāo)準(zhǔn)濃度胰蛋白酶脫壁組更多。該結(jié)果表明，與胰蛋白酶消化脫落法相比，超聲震蕩與低濃度胰蛋白酶組合的脫壁方法對(duì)細(xì)胞的損傷更小。該方法雖證實(shí)了超聲換能器在自動(dòng)化細(xì)胞脫壁中的可行性，但仍未能避免使用胰蛋白酶。

本文研究了一種超聲震蕩細(xì)胞脫壁方法，設(shè)計(jì)了綜合考慮脫壁自動(dòng)化應(yīng)用需求和實(shí)驗(yàn)需求的超聲換能單元，并以輸入信號(hào)、瓶內(nèi)液體、距離位置等控制參數(shù)為變量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探究了超聲脫壁過程中各參數(shù)對(duì)脫壁效果的影響，得到了最佳脫壁效果的對(duì)應(yīng)控制參數(shù)。

2 材料和方法

2.1 超聲震蕩系統(tǒng)

超聲震蕩系統(tǒng)由控制中心、信號(hào)發(fā)生、信號(hào)檢測、移動(dòng)控制和超聲震蕩組成，如圖 1 所示?？刂浦行牟倏匦盘?hào)發(fā)生和移動(dòng)控制部分，控制信號(hào)發(fā)生器產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)所需信號(hào)后，經(jīng)高功率放大器(ATA-4052，Aigtek，中國)放大及示波器(DZ4000，rigol，中國)信號(hào)檢測，然后輸入超聲換能單元。

圖1 超聲震蕩系統(tǒng)Fig. 1 Ultrasonic vibration experimental system

超聲換能單元由 4 個(gè)超聲波換能器(40k-60，廣源達(dá)，中國)正方形排列組成，如圖 2 所示。直線滑臺(tái)帶動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，通過調(diào)節(jié)貼壁細(xì)胞層與換能器的間距d，來調(diào)整細(xì)胞在超聲能場中的位置。超聲換能器上放置的凹槽負(fù)責(zé)承載超聲波傳導(dǎo)介質(zhì)。

圖2 超聲震蕩單元示意圖Fig. 2 Schematic diagram of ultrasonic vibration device

2.2 細(xì)胞制備

使用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為超聲脫壁實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)細(xì)胞。其培養(yǎng)過程為：首先，將冷凍保存于液氮中的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞置于 37 ℃ 恒溫水浴中復(fù)蘇后，使用離心法從冷凍保護(hù)劑溶液中分離細(xì)胞；其次，在添加 10% 胎牛血清的 D-MEM/F12 培養(yǎng)基(D8900，Sigma-Aldrich MO，美國)中孵育細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中加入 0.89% 青鏈霉素(15140-122，Gibco，美國)、1 μg 血管內(nèi)皮生長因子(100-20-10，Peprotech，美國)和 1 μg 血小板衍生生長因子(100-14B-10，Peprotech，美國)；再次，將細(xì)胞置于濕潤的 5% CO2的 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 d；最后，用 0.05% 胰蛋白酶(15400054，Gibco，美國)消化處理，3 d 后進(jìn)行細(xì)胞傳代。第三代細(xì)胞使用血替培養(yǎng)基培養(yǎng)，血替培養(yǎng)基是在間充質(zhì)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(6114011，DAKEWE，中國)中添加 4.7% 血清替代物(EPA-0 50，Elitecell Biomedical Corp，加拿大)和 0.95% 青鏈霉素(15140-122，Gibco，美國)。該孵育樣品為后續(xù)細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)的原代細(xì)胞。

2.3 超聲脫壁實(shí)驗(yàn)參數(shù)選擇

超聲單元控制信號(hào)的輸入幅值和作用時(shí)間直接決定了作用在細(xì)胞上的流體切向力的大小和時(shí)長；輸入信號(hào)波形的不同也會(huì)導(dǎo)致流體切向力不同；震蕩的頻率不僅關(guān)系到換能器的頻率特性和方向特性，而且影響換能器的發(fā)射功率、效率和靈敏度等重要性能指標(biāo)；頻率也是超聲脫壁實(shí)驗(yàn)中重要的影響參數(shù)。通常超聲換能器工作在自身的諧振基頻時(shí)獲得最佳工作狀態(tài)，產(chǎn)生最大發(fā)射功率和效率。但由于低頻超聲對(duì)細(xì)胞的空化會(huì)損傷細(xì)胞，因此，諧振基頻并非最佳選擇，需要以輸入信號(hào)頻率為變量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

Imashiro 等[32]研究了超聲換能器的超聲波特性，聲場特性示意圖如圖 3 所示，公式(1)中的近場距離N指示了聲場分布特性。

圖3 超聲換能器聲場示意圖Fig. 3 Schematic diagram of sound field of ultrasonic transducer

其中，D為換能器直徑(mm)；f為超聲換能器頻率(Hz)；c為介質(zhì)中的聲速(m/s)。聲場中聚焦區(qū) 與焦距F及N的關(guān)系如公式(2)所示。

聲強(qiáng)度I可由公式(3)計(jì)算得到。

其中， 為介質(zhì)密度；A為振動(dòng)幅值。

基于聲場特性可知，貼壁細(xì)胞層與換能器的距離d會(huì)直接影響細(xì)胞所受剪切力和瓶中液位的高度。

瓶內(nèi)液體成分也是影響超聲脫壁實(shí)驗(yàn)的因素之一，大量超聲脫壁實(shí)驗(yàn)使用磷酸鹽緩沖鹽水代替培養(yǎng)基作為震蕩時(shí)瓶內(nèi)的液體。培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，但不利于細(xì)胞脫壁，為平衡細(xì)胞脫落率與死亡率，瓶內(nèi)液體成分也需要作為控制變量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

基于上述分析，本文選擇超聲單元控制信號(hào)的幅值、頻率、作用時(shí)間、震蕩方式、細(xì)胞與超聲換能單元間距、瓶內(nèi)液體類型及液體高度作為控制參數(shù)開展實(shí)驗(yàn)。

2.4 超聲脫壁實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

細(xì)胞超聲脫壁實(shí)驗(yàn)的流程如圖 4 所示。先在超聲換能器上置凹槽內(nèi)加入與距離d同等高度的去離子水，充當(dāng)超聲波傳導(dǎo)介質(zhì)。接著取出待實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，將細(xì)胞瓶中培養(yǎng)原液替換為待測液體，并使用基于亮場顯微鏡的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞融合度檢測方法[33]檢測細(xì)胞脫壁情況。檢測完成后，細(xì)胞貼壁層置下，用滑臺(tái)夾持器固定培養(yǎng)瓶，控制步進(jìn)電機(jī)，使貼壁層移動(dòng)到指定距離d處，與培養(yǎng)瓶接觸傳導(dǎo)介質(zhì)。利用信號(hào)發(fā)生器和功率放大器，為超聲換能器施加指定波形，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超聲震蕩實(shí)驗(yàn)。

圖4 細(xì)胞超聲脫壁實(shí)驗(yàn)流程Fig. 4 Experimental procedure of ultrasonic detachment of cells

震蕩結(jié)束后，不使用移液管進(jìn)行吹打，直接收集震落細(xì)胞，并再次檢測瓶內(nèi)剩余細(xì)胞融合度，計(jì)算細(xì)胞脫壁面積的百分比，即細(xì)胞脫落率。此外，利用臺(tái)盼藍(lán)特性檢測細(xì)胞死亡率，即活細(xì)胞的胞膜結(jié)構(gòu)完整，能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞會(huì)被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。

為更加直觀地判斷細(xì)胞震蕩脫落效果，引入脫落效果參數(shù)K作為判斷依據(jù)，K為細(xì)胞脫落率和細(xì)胞成活率的乘積，K值越大脫落效果越好。

每組實(shí)驗(yàn)對(duì) 3 瓶細(xì)胞進(jìn)行相同的處理，以降低單瓶細(xì)胞導(dǎo)致的誤差，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 4 次。采用t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，當(dāng)P＜0.05 時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 材料和方法

3.1 輸入信號(hào)對(duì)細(xì)胞脫壁影響

3.1.1 輸入電壓對(duì)細(xì)胞脫壁影響

超聲換能器的輸入電壓直接影響細(xì)胞受到的超聲輻射壓力[34]，本研究選擇 200 V、240 V、280 V、320 V 的電壓作對(duì)照實(shí)驗(yàn)，頻率為 160 kHz，時(shí)間為 2 min，距離d＝2 mm，使用 15 mL 生理鹽水作為瓶內(nèi)液體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，施加電壓為200 V 時(shí)，基本無細(xì)胞脫落；施加電壓為 240 V時(shí)，細(xì)胞脫落面積約為 40%；施加電壓為 280 V和 320 V 時(shí)，細(xì)胞脫落面積均為 85%。使用臺(tái)盼藍(lán)觀察震蕩脫落細(xì)胞可知，施加電壓為 320 V 時(shí)，震落細(xì)胞成活率明顯低于其他 3 組，如圖 5 所示，施加電壓約為 280 V 時(shí)，脫落效果K最佳。

圖5 電壓對(duì)細(xì)胞脫落影響Fig. 5 Effect of voltage on detachment rate

電壓對(duì)細(xì)胞脫落效果影響較大，為選擇更為合適的電壓，本研究以 5 V 為步長，補(bǔ)充進(jìn)行了 240～280 V 之間的震蕩實(shí)驗(yàn)，最終選擇K值最高時(shí)所對(duì)應(yīng)的施加電壓 255 V 作為最佳輸入電壓。

3.1.2 輸入頻率影響

為測試輸入頻率對(duì)細(xì)胞脫落效果的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇超聲換能器實(shí)際振蕩頻率及諧振頻率：37.5 kHz、105 kHz、160 kHz 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。電壓設(shè)置為 255 V，時(shí)間為 2 min，距離d＝2 mm，使用 15 mL 生理鹽水作為瓶內(nèi)液體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)輸入頻率為 37.5 kHz 與 160 kHz 時(shí)，細(xì)胞脫落面積均可達(dá)到 85%，然而，當(dāng)輸入頻率為 105 kHz 時(shí)，細(xì)胞脫落面積僅為 30%。如圖 6所示，160 kHz 組細(xì)胞成活率大于 37.5 kHz 組，與理論一致，且脫落效果K在頻率為 160 kHz 時(shí)達(dá)到最佳。

圖6 頻率對(duì)細(xì)胞脫壁影響Fig. 6 Effect of frequency on detachment rate

3.1.3 輸入波形影響

為更直觀地感受波形的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇致細(xì)胞脫落率較低的 105 kHz 區(qū)間頻率，對(duì) 105 kHz持續(xù)脈沖、104.7～106.4 kHz 掃頻脈沖和 105 kHz突發(fā)脈沖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在同諧振頻率區(qū)間中，細(xì)胞脫落面積為：掃頻脈沖＞持續(xù)脈沖＞突發(fā)脈沖，而三者細(xì)胞死亡率沒有明顯區(qū)別。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用 159～161 kHz 掃頻脈沖進(jìn)行細(xì)胞脫落。

3.2 細(xì)胞與超聲裝置間的距離 d 對(duì)細(xì)胞脫壁影響

細(xì)胞與超聲裝置間的距離d對(duì)細(xì)胞的脫壁有一定影響。設(shè)置d為 2 mm、3 mm、4 mm，電壓為 255 V，掃頻脈沖頻率為 159～161 kHz，時(shí)間為 2 min，使用 15 mL 生理鹽水作為瓶內(nèi)液體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在 2 mm 處細(xì)胞脫落面積約為 85%，在 3 mm 處細(xì)胞脫落面積約為 95%，在4 mm 處細(xì)胞脫落面積約為 60%，其中，2 mm 組成活率最低，如圖 7 所示，脫落效果K在距離d為 3 mm 時(shí)達(dá)到最佳。

圖7 距離對(duì)細(xì)胞脫壁影響Fig. 7 Effect of distance on detachment rate

3.3 震蕩瓶內(nèi)液體對(duì)細(xì)胞脫壁影響

3.3.1 瓶內(nèi)液體成分

以瓶內(nèi)液體成分為變量，選擇 15 mL 血替原液、15 mL 生理鹽水、7.5 mL 血替原液＋7.5 mL生理鹽水分別作為瓶內(nèi)液體 a、b、c 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其他參數(shù)設(shè)置：電壓為 255 V，頻率為 159～161 kHz掃頻脈沖，時(shí)間為 2 min，距離d＝3 mm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，15 mL 血替原液組細(xì)胞脫落面積約為5%；15 mL 生理鹽水組細(xì)胞脫落面積約為 95%，死亡率約為 30%；7.5 mL 血替原液＋7.5 mL 生理鹽水組細(xì)胞脫落面積約為 60%，死亡率約為30%。如圖 8 所示，脫落效果K在瓶內(nèi)溶液為15 mL 生理鹽水時(shí)達(dá)到最佳。

圖8 瓶內(nèi)液體對(duì)細(xì)胞脫壁影響Fig. 8 Effect of liquid on detachment rate

3.3.2 瓶內(nèi)液位高度h對(duì)細(xì)胞脫壁影響

本實(shí)驗(yàn)選擇生理鹽水作為液體，溶液體積設(shè)置為 9 mL、10.5 mL、12 mL、13.5 mL、15 mL，即液體高度為 1.2 mm、1.4 mm、1.6 mm、1.8 mm、2.0 mm。其他參數(shù)設(shè)置：電壓為 255 V，掃頻脈沖頻率為 159～161 kHz，時(shí)間為 2 min，距離d＝3 mm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從細(xì)胞脫落的面積看，溶液高度 1.2 mm 組脫壁面積最小，其次為 1.4 mm 組和 1.6 mm 組，1.6 mm 以上的實(shí)驗(yàn)組脫壁面積類似，基本可以全部脫落；從脫落細(xì)胞的成活率看，液體高度小于 1.6 mm 組細(xì)胞成活率均較高，液體高度較大的兩組成活率較低。如圖 9 所示，當(dāng)瓶內(nèi)溶液高度h為 1.6 mm，即液體體積為12 mL 時(shí)，脫落效果K達(dá)到最佳。

圖9 液體高度對(duì)細(xì)胞脫壁影響Fig. 9 Effect of liquid height on detachment rate

4 結(jié)論與分析

本文利用超聲換能單元，以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為目標(biāo)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，針對(duì)超聲脫壁過程中關(guān)鍵參數(shù)對(duì)脫壁效果、細(xì)胞活性等指標(biāo)的影響進(jìn)行了研究實(shí)驗(yàn)，結(jié)果分析如下。

不同電壓對(duì)細(xì)胞脫落效果影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電壓與細(xì)胞脫落率成正相關(guān)，與細(xì)胞成活率呈負(fù)相關(guān)，即增大電壓可以增大細(xì)胞脫落面積，但是會(huì)降低細(xì)胞成活率。這是因?yàn)殡妷旱脑龃髸?huì)造成液體振幅的增大，進(jìn)而導(dǎo)致流體剪切力增大，在提高脫落率的同時(shí)會(huì)加重對(duì)細(xì)胞的傷害，造成成活率的降低。因此，在致脫落率較大的電壓中，選擇對(duì)細(xì)胞傷害相對(duì)較小的電壓，在本實(shí)驗(yàn)條件下，較合適電壓為 255 V。

不同頻率對(duì)細(xì)胞脫落效果影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞脫落率與頻率并無線性關(guān)系，但頻率增大會(huì)提高細(xì)胞成活率。該結(jié)論與相關(guān)文獻(xiàn)的結(jié)論一致[35]，原因是超聲波會(huì)在流體中引起空化效應(yīng)，即氣泡的形成和破裂。氣泡破裂會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，超聲頻率越高，產(chǎn)生的氣泡越小，對(duì)細(xì)胞的傷害也就越低。因此，選擇致脫落率類似的較高次諧振頻率，本實(shí)驗(yàn)中 160 kHz 為最佳。此外，與 Wang 等[36]的發(fā)現(xiàn)類似，在細(xì)胞的破壞實(shí)驗(yàn)中，高頻和低頻超聲交替配合比僅用單頻處理更有效，原因是使用高低交替頻率產(chǎn)生的流體剪切力會(huì)大于單頻。因此，在輸入波形的實(shí)驗(yàn)中可以觀察到，相同的頻率區(qū)間內(nèi)，在細(xì)胞成活率相同的前提下，掃頻脈沖可以提升細(xì)胞脫落率。

在 Inui 的研究中，超聲換能器與瓶底距離越近，脫壁面積越精準(zhǔn)；液體體積越多越易脫壁。而在本文實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞脫落率與距離d并無線性關(guān)系。由于培養(yǎng)瓶結(jié)構(gòu)原因，細(xì)胞貼壁層與超聲震蕩裝置距離d為 2 mm 時(shí)，培養(yǎng)瓶與超聲震蕩裝置存在物理接觸，因此猜測此時(shí)細(xì)胞脫落死亡率較高的原因?yàn)?，接觸導(dǎo)致增加了機(jī)械振動(dòng)力，損傷了細(xì)胞。但 3 mm 處脫落率反而增大，結(jié)合瓶中液位高度h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文認(rèn)為細(xì)胞脫落率可能與駐波出現(xiàn)位置相關(guān)。

在含有培養(yǎng)基的液體中，細(xì)胞脫壁效果不佳，而使用生理鹽水作為脫壁液體效果更好，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基本身具有促進(jìn)貼壁的成分。在工業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)傳代過程中，通常使用生理鹽水進(jìn)行清洗或離心，因此在細(xì)胞脫壁時(shí)，使用生理鹽水作為細(xì)胞震蕩液體是可行的。

與 Inui 的聚能型超聲換能器脫壁法相比，本文超聲震蕩裝置脫壁方法實(shí)現(xiàn)了更大范圍的細(xì)胞脫壁，并確定了應(yīng)用于自動(dòng)化流程中細(xì)胞脫壁的較優(yōu)條件。與 Tauchi 提出的利用超聲換能器激發(fā)和低濃度胰蛋白酶協(xié)同分離細(xì)胞的方法相比，本文方法避免了胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞蛋白的傷害，還提高了超聲震蕩脫壁應(yīng)用與自動(dòng)化流程中的效率。

綜上所述，本文實(shí)驗(yàn)得出的最佳參數(shù)為：超聲換能器輸入電壓為 255 V，超聲頻率為159～161 kHz 掃頻，超聲時(shí)間為 2 min，細(xì)胞與超聲換能器距離為 3 mm，震蕩液體為 12 mL 生理鹽水。在該參數(shù)控制下，T75 瓶中細(xì)胞脫落效果K值可達(dá) 67%，脫落率為 95%，成活率為70%；胰蛋白酶脫落法的細(xì)胞脫落率約為 98%，成活率約為 81%；Kurashina 基于溫度調(diào)制的超聲振動(dòng)細(xì)胞脫壁方法的細(xì)胞脫落率約為 78%，成活率約 91%。由此可見，本實(shí)驗(yàn)方法的細(xì)胞脫落率與胰蛋白酶脫落法脫落率基本一致，但成活率較低。

在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中，在保證細(xì)胞脫落率的同時(shí)，需要研究提高成活率的方法?？赏ㄟ^更換超聲換能器、信號(hào)發(fā)生器等優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的方式，探究更高頻超聲脫壁是否可以提升細(xì)胞成活率。也可通過對(duì)其他影響因素的探究實(shí)驗(yàn)，尋找其他控制參數(shù)的更優(yōu)選擇。

5 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)了一個(gè)兼顧細(xì)胞自動(dòng)化生產(chǎn)應(yīng)用和待測參數(shù)實(shí)驗(yàn)的超聲換能單元，以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為目標(biāo)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，在避免使用胰蛋白酶的前提下，研究了超聲脫壁過程中的關(guān)鍵參數(shù)對(duì)脫壁效果、細(xì)胞活性的影響。

研究表明，電壓與細(xì)胞脫落率呈正相關(guān)，與細(xì)胞成活率負(fù)相關(guān)；細(xì)胞脫落率與頻率并無線性關(guān)系，但頻率增大會(huì)有效增加細(xì)胞成活率；相同的頻率區(qū)間內(nèi)，在不造成細(xì)胞損傷的前提下，掃頻脈沖對(duì)細(xì)胞的脫落率有所提升；當(dāng)細(xì)胞層處在駐波位置進(jìn)行震蕩時(shí)，細(xì)胞的脫落效果較好；當(dāng)瓶內(nèi)液體為純生理鹽水時(shí)，脫落效果最佳。

綜上所述，本文實(shí)驗(yàn)得出了應(yīng)用于工業(yè)自動(dòng)化流程的超聲震蕩致細(xì)胞脫落的較優(yōu)參數(shù)：超聲換能器輸入電壓為 255 V，超聲頻率為 159～161 kHz掃頻，超聲時(shí)間為 2 min，細(xì)胞與超聲換能器距離為 3 mm，震蕩液體為 12 mL 生理鹽水。該參數(shù)控制下，T75 瓶中細(xì)胞脫壁面積可達(dá) 95%，細(xì)胞成活率可達(dá) 70%。