郝 彬， 李 薇

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）

0 引 言

糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoids）具有抗炎、抗毒、抗過敏、抗休克、非特異性抑制免疫及退熱等多種作用，用于風(fēng)濕性疾病、自身免疫病、嚴(yán)重感染或炎性反應(yīng)以及過敏性疾病的治療，同時(shí)也是皮膚科臨床應(yīng)用最廣泛的外用藥物之一［1］。因長期使用糖皮質(zhì)激素會對人體造成嚴(yán)重危害，如引起激素依賴性皮炎、皮膚萎縮變薄及內(nèi)分泌紊亂等毒副作用［2-4］，2015年版的《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》將糖皮質(zhì)激素列為化妝品禁用組分。但因糖皮質(zhì)激素對皮膚具有顯著的消炎祛痘、美白護(hù)膚功效［2］，部分廠商為了謀取利益仍然非法將其加到化妝品中，因此化妝品中檢出各類激素的事件常有報(bào)道［5］。

我國自2010年開始實(shí)施國家標(biāo)準(zhǔn)《GB／T 24800.2-2009化妝品中四十一種糖皮質(zhì)激素的測定》。2019年9月，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布通告將《化妝品中激素成分的檢測方法》和《化妝品中抗感染類藥物的檢測方法》納入化妝品安全技術(shù)規(guī)范。為規(guī)避監(jiān)管，一些新的糖皮質(zhì)激素不斷被合成和添加，而法定檢驗(yàn)方法以及諸多化妝品中糖皮質(zhì)激素檢測方面的文獻(xiàn)均是基于已知糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品的液相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法［6-11］，雖然其檢測范圍不斷拓展至80多種［12，19］，但仍無法覆蓋所有的糖皮質(zhì)激素衍生物，導(dǎo)致逃避監(jiān)管的非法添加。

我們在日常檢測中發(fā)現(xiàn)了一種檢測標(biāo)準(zhǔn)之外的倍他米松類似物被非法添加到化妝品中，經(jīng)過QTOF一級、二級質(zhì)譜解析，與倍他米松的二級質(zhì)譜比對和二級碎片裂解機(jī)理推斷，并結(jié)合堿水解反應(yīng)的結(jié)果，確定了該物質(zhì)為倍他米松丁酸丙酸酯（無市售標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），同時(shí)根據(jù)水解產(chǎn)物倍他米松的檢測確定其在化妝品中的含量。倍他米松屬于長效、強(qiáng)效糖皮質(zhì)激素類藥物［13-14］，作用時(shí)間可持續(xù)36～54 h，是皮膚科常用的外用糖皮質(zhì)激素類藥物，也是化妝品中常添加的禁用物質(zhì)［15］。除了國家標(biāo)準(zhǔn)中列出的倍他米松醋酸酯、戊酸酯及雙丙酸酯，還可見丙酸酯［16-17］、雙乙酸酯［16］、雙戊酸酯［16］、硬脂酸酯［16］、苯甲酸酯［18-19］、丁酸乙酸酯［20］等諸多衍生酯。顯然在缺少標(biāo)準(zhǔn)品情況下無法應(yīng)用三重四極桿質(zhì)譜或高分辨質(zhì)譜進(jìn)行準(zhǔn)確的定性，更不可能進(jìn)行定量檢測。

本研究所建立的方法可應(yīng)用于其他倍他米松衍生酯的檢測，有助于解決該類激素可能逃避監(jiān)管的各種新型、未知衍生酯的檢測問題；為化妝品中非法添加糖皮質(zhì)激素成分的高通量篩選和確認(rèn)提供新的檢測思路，有助于質(zhì)監(jiān)和藥監(jiān)部門對化妝品市場進(jìn)行有效的監(jiān)管。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：LC 30A超高壓液相色譜儀（島津）；X500R四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Sciex）；Acquity UPLC超高壓液相色譜儀（Waters）；Qtrap 5500三重四極桿質(zhì)譜儀（AB Sciex）；5430R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；混合器（Eppendorf）；超聲波發(fā)生器（上海安譜）；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（Millipore）；固相萃取裝置（CNW，上海安譜）；N-EVAP 112氮吹儀（Organomation Associates）。

試劑：甲酸（MS級，ThermoFisher）；甲醇、乙腈（HPLC級，Merk）；倍他米松、地塞米松（Macklin）；Oasis HLB固相萃取柱（60 mg／3 mL，Waters）；待測化妝品試樣（水樣溶液，來自某化妝品代工廠家送檢樣品）。

1.2 對照品溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量倍他米松、地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇分別配制成濃度為100 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，根據(jù)需要逐級稀釋成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 待測樣品溶液的制備

（1）提取和固相萃?。⊿PE）凈化。取化妝品試樣1.0 mL于15 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋混勻，超聲提取20 min，14 000 r／min離心10 min，收集上清液于15 mL聚丙烯塑料離心管中，于50℃水浴中氮?dú)獯蹈珊螅尤? mL 30%甲醇水溶液溶解殘?jiān)?，所得溶液進(jìn)行固相萃取。固相萃取柱依次用6 mL甲醇活化、6 mL水平衡后，將樣品溶液過柱，先用6 mL 30%甲醇水溶液淋洗，再用6 mL 80%甲醇水溶液洗脫。SPE洗脫液于4℃下140 00 r／min高速離心10 min，取上清液進(jìn)行液質(zhì)分析或進(jìn)行后續(xù)的堿水解反應(yīng)。

（2）樣品的堿水解。取20 μL SPE洗脫液于2 mL塑料離心管中，依次加入280 μL乙腈和0.1 mol／L NaOH溶液100 μL，渦旋10 s后置于Thermomixer中，25℃下600 r／min反應(yīng)30 min，取樣100 μL加入25 μL 0.1 mol／LHCl溶液，渦旋混勻，待液質(zhì)分析。

1.4 定性分析條件

（1）LC 30A色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters）；流動相A為水溶液，B為乙腈，流速0.4 mL／min，柱溫45℃，梯度洗脫程序：0～20 min，B相從20%線性升至65%；20～22 min，B相維持95%；22～22.1 min，B相從95%線性降至20%并保持至24 min。

（2）X500R質(zhì)譜條件。離子源溫度為550℃；簾氣、輔助氣1和輔助氣2均為310.264 kPa；離子源電壓為5.5 kV；正離子IDA掃描模式；質(zhì)量掃描范圍m／z 50～1 000；解簇電壓為80 V；碰撞能量為35 V；數(shù)據(jù)采集處理軟件：Sciex OS 1.6.2。

1.5 定量分析條件

（1）Acquity UPLC色譜條件。色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm；Waters）；流動相A為水溶液，B為乙腈，流速0.4 mL／min，柱溫45℃，梯度洗脫程序：0～2 min，B相從20%線性升至30%；3～4 min，B相從30%線性升至95%；4～5 min，B相維持95%；5～6 min，B相降至20%。

（2）Qtrap 5500質(zhì)譜條件。離子源溫度：500℃；簾氣、輔助氣1和輔助氣2均為310.264 kPa；離子源電壓：5 kV；ESI＋模式下倍他米松多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）條件：393.2→373.4，CE＝15；393.2→355.2，CE＝18；數(shù)據(jù)采集軟件：Analyst 1.6.3，數(shù)據(jù)處理軟件：MultiQuan 2.1.1。

2 結(jié)果與討論

2.1 化妝品中未知糖皮質(zhì)激素的定性分析

待測樣品的總離子流圖（見圖1（a））中16.85 min質(zhì)譜峰對應(yīng)的一級質(zhì)譜圖提示m／z 519.274 3（見圖1（b）），對應(yīng)的分子式為C29H39FO7，并不在國標(biāo)檢測的41種糖皮質(zhì)激素范圍內(nèi)。m／z 519.274 3的二級質(zhì)譜碎片中出現(xiàn)m／z 393.204 2，與地塞米松、倍他米松的m／z一致，同時(shí)其他主要碎片離子，如m／z 337.178 4、319.168 3、291.173 9、279.173 7、277.158 6、263.142 4、185.096 0、171.081 2、147.080 1與地塞米松、倍他米松的碎片相同；僅有個別離子是特異性的，如m／z 115.039 0、411.215 3、87.043 2、71.047 3、57.033 4（見圖1（c），圖2）。因此可推測待測樣品中的糖皮質(zhì)激素為地塞米松或倍他米松的衍生物。

圖1 待測樣品的QTOF質(zhì)譜圖

圖2 待測樣品與倍他米松的二級質(zhì)譜圖比較

地塞米松和倍他米松是一對同分異構(gòu)體，兩者可達(dá)到色譜分離，保留時(shí)間分別為6.75和6.60 min（圖3（b））。待測樣品中的糖皮質(zhì)激素經(jīng)堿水解后產(chǎn)物保留時(shí)間為6.60 min（圖3（a）），因此確定其為倍他米松酯。根據(jù)分子式C29H39FO7檢索ChemSpider數(shù)據(jù)庫可得到2個倍他米松衍生酯：戊酸醋酸倍他米松及丁酸丙酸倍他米松。

圖3 待測樣品堿水解后提取離子流圖（a）及倍他米松、地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品提取離子流圖（b）

進(jìn)一步分析待測樣品二級質(zhì)譜中的特異性碎片并總結(jié)其裂解規(guī)律（見圖4），m／z 57.033 4對應(yīng)于丙酸根，m／z 71.047 3對應(yīng)于丁酸根，m／z 87.043 2對應(yīng)于丁酸基團(tuán)，m／z 115.039 0提示丙酸的結(jié)合位點(diǎn)在21-OH上，因此根據(jù)四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜的一級和二級數(shù)據(jù)可確定待測樣品中的未知糖皮質(zhì)激素為17-丁酸-21-丙酸倍他米松（丁丙倍他米松）。

圖4 未知糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜裂解規(guī)律

2.2 酯類糖皮質(zhì)激素的堿水解條件優(yōu)化及定量

0.4%的NaOH水溶液、1.0%的Na2CO3水溶液和1.0%的LiOH水溶液均可水解倍他米松酯生成倍他米松，0.4%NaOH在30 min內(nèi)可將丁丙倍他米松水解完全（見圖5）。取系列濃度的倍他米松標(biāo)準(zhǔn)品按低濃度到高濃度連續(xù)進(jìn)樣，以被測物濃度（x）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積（y）為縱坐標(biāo)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線，y＝13 467x－4 862，R2＝0.997 9。將待測樣品SPE的甲醇洗脫液經(jīng)0.4%NaOH水解30 min后測定其中的倍他米松濃度為39.2 ng／mL，根據(jù)摩爾比和稀釋倍數(shù)可計(jì)算得到未知樣品中丁丙倍他米松的含量為310 ng／mL。

圖5 丁丙倍他米松的水解時(shí)間曲線（以最大的峰面積為100%）

3 結(jié) 語

本研究首次應(yīng)用堿水解和高分辨質(zhì)譜鑒定了待測化妝品中非法添加的糖皮質(zhì)激素-倍他米松丁酸丙酸酯，使用現(xiàn)有國家化妝品安全技術(shù)規(guī)范所列檢測方法無法檢出該激素。在無標(biāo)準(zhǔn)品情況下通過水解反應(yīng)后對倍他米松的定量檢測，確定了待測化妝品中丁丙倍他米松的含量為310 ng／mL。本研究可對化妝品中未知無市售標(biāo)準(zhǔn)品的酯類糖皮質(zhì)激素進(jìn)行快速定性、定量分析，從而有效檢測藥品、食品、保健品、化妝品中的非法添加，是對現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)檢測化妝品中糖皮質(zhì)激素物質(zhì)的有力補(bǔ)充。